11.3. Влияние условий оплодотворения на его эффективность

Известно, что для успешного оплодотворения ооцитов, сперматозоиды млекопитающих проходят процесс созревания или капацитации. В естественных условиях этот процесс происходит в половых путях самок и заключается в изменении характера плавательной активности и преобразовании строения клеточных мембран на головке спермиев, после чего спермотазоид становится способным к пенетрации ооцита. Кроме этого характерными особенностями прохождения процесса капацитации является переход спермиев от прямолинейно-поступательного к «гиперактивному» и снова к прямолинейно-поступательному движению. По завершении капацитации отдельные спермии начинают агрегировать между собой.

Для в оплодотворения ооцитов использовали замороженно-оттаяную сперму. Для капацитации использовали разработанные нами питательные среды на основе ТС-199 и Тироде. В качестве капацитирующего агента использовался гепарин в различных концентрациях (50, 100, 150, 200 и 250 ед/мл). Эффективность капацитации определяли по активности спермы, агрегации сперматозоидов, уровню дробления и выходу жизнеспособных зародышей.

Таблица 104 - Показатели капацитирующие способности гепарина в зависимости от концентрации

Как видно из анализа таблицы 104 по мере увеличения концентрации гепарина все показатели спермы возрастали. Так, если 50% концентрация гепарина не оказала заметного влияния на характеристику спермы то ее повышение увеличивало продолжительность гиперактивного движения с 30 (100ед/мл) до 135минут (250ед/мл), долю спермиев с гиперактивным движением с 15до 80%, а уровень агрегации спермиев с 5,7 до 57.0%.

Оплодотворяющую способность спермы определяли по уровню дробления и выходу полноценных зародышей на стадии морула-бластоциста (табл. 105)

Таблица 105 - Показатели оплодотворяющей способность спермы в зависимости от концентрации гепарина в качестве капацитирующего агента

Установлено, что более высокий уровень дробления и выход эмбрионов на стадии морула-бластоциста был получен при применении гепарина и канцентрации 100 и 150 ед/мл - 49,356,7 и 23,3-19,3%, соответственно. При увеличении концентрации гепарина до 200-250 ед/мл эти показатели снижались и составили соответственно 34,0-17,8 и 12,0-10,0%.

Для изучения влияния различных сред на оплодотворяемость ооцитов за основу было взято 4 среды: ТС199, Тироде, Тироде М (модифицированная) и среда Игла (табл. 106).

Как видно из таблицы наиболее эффективной оказалась средаТироде с выходом эмбрионов на предимплантационных стадиях 19,2-25,8% При уровне дробления 54,5-61,6%, соответвтвенно.

Таблица 106 - Оплодотворяемость ооцитов в различных средах

В таблице 107 представлены результаты совместной инкубации спермы с ооцитами. Как видно из таблицы оплодотворяемость яйцеклеток находится в прямой зависимости от продолжительности совместного культивирования гамет. Так, при трехчасовом культивировании спермиев с ооцитами получено 14,9% дробящихся зародышей, из них 19,2% морулбластоцист, что составило 2,8% от общего количества использованных в опыте ооцитов. Увеличение времени совместного инкубирования клеток до 6-ти и 9-ти часов повысило оплодотворяемость ооцитов на 2,2 и 12,9%; уровень морул-бластоцист, по отношению к количеству оплодотворенных остался на прежнем уровне - 18,7; 22,0%, и составил 3,2 и 6,1% от ооцитов данных опытных групп. Дальнейшее возрастание продолжительности пребывания спермиев и яйцеклеток в одной чашке до 12-ти и 15-позволило получить 32,5 и 40% (Р<0,01) дробящихся зародышей, к 32,2 и 29,7% эмбрионов на предимплантационных стадиях, что соответствует 10,5 и 11,8% от общего количества поставленных на культивирование клеток. При 18-ти часовом инкубировании оплодотворилось (Р<0,001) яйцеклеток, из них получено 32,1% Мо-В1, что составило от всех клеток в группе. Наиболее оптимальным является время 18,1-20,0 часов, где получено