ГЛАВА 8. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ
Замораживание и оттаивание живых клеток представляет собой комплексный физико-химический процесс, регулируемый тепло- и водообменом между клеткой и окружающей ее средой, в течение которого жидкая фаза биообъектов переходит в твердую и наоборот /327, 333/.
Жизнеспособность клеток при охлаждении и замораживании зависит от ряда факторов, таких, например, как скорость охлаждения, поверхностно-объемное отношение, проницаемость клеточных мембран, температурные коэффициенты проницаемости /212, 237, 274/.
Для более полного понимания механизма замораживания и оттаивания эмбрионов остановимся на некоторых термодинамических процессах, происходящих в клетке в этот период.
Известно, что только 20% клеточной субстанции находится в твердом состоянии, все остальные клеточные компоненты находятся в водном растворе, находящемся в равновесии с окружающей средой. Поэтому, если обыкновенная вода замерзает при 0 ° С, то присутствие в клеточной субстанции ионов растворенных в ней солей, при отрицательных температурах близких к 0 ° С, понижает точку замерзания, т.е. раствор охлаждается ниже точки своего замерзания без образования льда.
При дальнейшем охлаждении происходит спонтанное образование центров кристаллизации, сопровождающееся нарастанием фронта кристаллизации и резким повышением температуры, поскольку изменение агрегатического состояния меняет накопленную между частичками клетки тепловую энергию, которая в зависимости от образования кристаллов или их оттаивания соответственно отдается или поглощается /200/.
При образовании кристаллов часть воды вымораживается, а концентрация веществ в растворе повышается, что ведет к дестабилизации осмотического равновесия. На эти изменения
клетка отвечает осмотической реакцией, т.е. отдачей воды в экзоцеллюлярную среду для выравнивания осмоса с последующим образованием интроцеллюлярного льда /199, 197/. Однако, с отдачей клеткой воды во внешнюю среду, повышается концентрация солей в самой клетке, и поэтому, от того, с какой скоростью клетка отдает или поглощает воду, во многом зависит сохранность клеточных структур и даже самой клетки во время криоконсервации /235/.
Медленное охлаждение дает клеткам возможность довольно быстро отдавать воду и таким образом поддерживать осмотическое равновесие. Но следует отметить тот факт, что при слишком низкой скорости охлаждения клетка теряет воду чрезвычайно быстро. При этом во внеклеточной среде образуются кристаллы, а эмбрион по причине длительного нахождения в растворе с повышенной концентрацией веществ обезвоживается, что служит причиной повреждения внутриклеточных структур и гибели эмбриона.
При слишком высокой скорости охлаждения, наоборот, вода не успевает своевременно уходить из клетки, и кристаллы образуются уже в клетке, что также приводит к ее гибели /213/.
Таким образом, как слишком медленное, так и слишком быстрое охлаждение служит причиной гибели зародышей. В первом случае – из-за обезвоживания, во втором – из-за внутриклеточного образования льда /211, 358/.
Для исключения невосстановимых криоповреждений и гибели клеток необходимо концентрационные и температурные изменения отрегулировать на осмотическое равновесие эмбриона.
Отрицательное влияние рассмотренных выше факторов при криоконсервировании клеток можно снизить путем применения криопротекторов и оптимальной скорости охлаждения. Однако, криопротекторы, хотя и обладают свойством предохранения клеток и тканей от возможных негативных воздействий при замораживании и оттаивании, могут и сами повреждать клетки эмбриона посредством осмотических изменений /270/.
Клетки, помещенные в среду, не имеющую проникающих криофилактиков в повышенной концентрации и не проникающих в нейтральной концентрации, реагируют на повышение осмолярности. Реакция, заключающаяся в изменении объема клеток и цитоплазматической воды, зависит от пропускной способности клеток для воды и криопротекторов, температуры и времени /157, 194/. При этом возможны следующие варианты:
-
Мембраны клеток не в состоянии пропустить криопротектор, в результате клетка сжимается до осмотического равновесия;
-
Пропускная способность мембран для воды выше, чем для криофилактика. В этом случае клетка сжимается до определенной величины с последующим набуханием до осмотического равновесия ;
-
Одинаковая пропускная способность для воды и криопротектора. В данном случае клеточная масса несколько увеличивается; 4. Пропускная способность для криопротектора выше, чем для воды, в результате чего клетка увеличивается до максимума с последующим уменьшением до новой величины осмотического равновесия.
Таким образом, во всех случаях, кроме первого, эндоцеллюлярная и экзоцеллюлярная концентрация криопротектора с течением времени достигает осмотического равновесия, а объем клеточной массы, из-за наличия в клетке проникающего криопротектора, становится больше /272/.
Достижение эмбрионом первоначального объема говорит об окончании химической эквилибрации, которая по данным некоторых исследователей /183, 185/ должна составлять 10…15 мин. При недостаточном насыщении клеток криопротектором эмбрионы во время замораживания могут получить криоповреждения, связанные с недостатком криозащиты.
По характеру действия различают два типа криопротекторов: проникающие и непроникающие в клетку. К первой группе относятся глицерин, диметилсульфоксид
