11.2. Использование биологически активных веществ в культуральных системах in vitro
11.2.1. Эффективность использования фолликулярной жидкости в культуральных системах in vitro
Для получения фолликулярной жидкости ее аспирировали из фолликулов заданного диаметра. Для предотвращения коагуляции добавляли гепарин в концентрации (0,1 мг/мл). Затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут, фильтровали через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,22 µm и замораживали и по мере необходимости оттаивали.
В процессе экспериментов определялась эффективность использования фолликулярной жидкости из фолликулов диаметром 2-3 мм, 3-6 мм и > 6 мм фолликулярной жидкости из фолликулов коров, находящихся в лютеиновой и фолликулярной фазах полового цикла в концентрации 5, 10, 15 и 20% от объема питательной среды.
Результаты эффективности использования фолликулярной жидкости крупного рогатого скота из фолликулов разного диаметра представлены в таблице 94.
Таблица 94 - Эффективность использования фолликулярной жидкости крупного рогатого скота из фолликулов разного диаметраи разные фазы цикла
| Группа | Диаметр фолликулов, мм; фаза цикла | Кол-во ооцитов, n | Количество дробящихся, n-% | В том числе | |
|---|---|---|---|---|---|
| Мо+Бл, n-% | Из них | ||||
| Бл, n-% | |||||
| 1. | контроль | 110 | 57 - 54,8 | 38 - 34,5 | 13 – 11,8 |
| 2. | 2-3 мм | 97 | 65 – 67,0 | 39 – 40,2 | 14 – 14,4 |
| 3. | 3-6 мм | 130 | 75 - 57,6 | 54 - 41,5 | 17 – 13,1 |
| 4. | > 6 мм | 84 | 41 – 48,8* | 30 – 35,7 | 10 – 11,9 |
| 5. | Фолликулярн ая фаза | 68 | 37 – 54,4 | 20 – 29,4 | 7 – 10,3 |
| 6. | Лютеиновая фаза | 73 | 36 – 49,3 | 16 – 21,9 | 6 – 8,2 |
Анализ результатов, представленных в таблице 1, показывает, что уровень оплодотворения во второй группе на 9,4 – 18,2% превышал уровень оплодотворения в других группах. При этом разница между второй и четвертой группами оказалась достоверной (Р<0,05). По выходу эмбрионов на предимплантационных стадиях у второй и третьей групп показатели получены практически одинаковые 40,2 и 41,5%, соответственно, что на 5,7; 4,5 и 7; 5,8% выше по сравнению с контролем и четвертой группой, ооциты которой культивировались в присутствии фолликулярной жидкости из фолликулов диаметром более 6 миллиметров.
Что касается уровня выхода эмбрионов на стадии развития бластоциста, то здесь особых различий не наблюдалось, колебания составляли от 11,9% в присутствии фолликулярной жидкости из больших фолликулов до 14,4% из малых фолликулов (2-3 мм). В контроле данный показатель составил 11,8%. По качеству все бластоцисты были отличными. Уровень трансформации морул в бластоцисты в контроле составил 34,2%, в первой опытной – 35,9%, во второй – 31,5% и в третьей – 33,3%.
Таким образом, достоверных различий по выходу эмбрионов на стадии бластоциста в ходе опытов не установлено, что также относится и к эффективности использования фолликулярной жидкости от доноров, находящихся на разных стадиях полового цикла.
В таблице 95 представлены результаты исследований по определению влияния концентрации фолликулярной жидкости на эффективность получения эмбрионов в системе in vitro.
Как видно из приведенных данных наиболее эффективным оказалось использование фолликулярной жидкости в концентрации 10%. Так, выход дробящихся зародышей в этой группе составил 65,2%, что достоверно превышало данный показатель в группе ооцитов, культивировавшихся в присутствии 5% фолликулярной жидкости (Р<0,01) и в группе ооцитов, культивировавшихся в присутствии 20% фолликулярной жидкости (Р<0,05). Общий выход морул-
бластоцист в этой группе превышал аналогичный показатель в первой группе на 4,4%, в третьей на 5,2% и в четвертой на 8,1%; в том числе по выходу бластоцист на 3,8%; 2,1%; 3,2%, соответственно. Что касается качества бластоцист, то наиболее низкий показатель оказался в группе ооцитов с концентрацией фолликулярной жидкости 20% и составил 66,7%, что на 33,3%; 26,6%; 22,2% ниже по сравнению с первой, третьей и четвертой группами, соответственно.
Таблица 95 - Влияние концентрации фолликулярной жидкости на уровень оплодотворения и выход жизнеспособных зародышей
| № п/п | Конц. фол. ж-ти, % | Кол-во ооцитов, n | Количество зародышей, n - % | ||
|---|---|---|---|---|---|
| дробящихся | Мо-Бл | в том числе | |||
| Бл | |||||
| 1. | 5 | 96 | 43–44,8*** | 20–20,8 | 7–7,3 |
| 2. | 10 | 135 | 88–65,2 | 34–25,2 | 15–11,1 |
| 3. | 15 | 100 | 55–55,0 | 20–20,0 | 9–9,0 |
| 4. | 20 | 114 | 57–50,0** | 19–16,7 | 9–7,9 |
In vivo фолликулярная жидкость является естественной средой созревания и развития ооцитов. В искусственных условиях для обеспечения необходимых условий созревания ооцитов и культивирования ранних зародышей чаще всего используется эстральная сыворотка крупного рогатого скота, включающая многочисленные компоненты, в том числе гормоны факторы роста и белки, способствующие эффективному созреванию ооцит-кумулюсных комплексов.
В таблице 96 представлена сравнительная эффективность использования в культуральных системах фолликулярной жидкости и эстральной сыворотки крупного рогатого скота.
Добавление данных компонентов в питательную среду проводилось в два этапа. В среде для созревания их концентрация составляла 5% от объема среды, через 96 часов после оплодотворения добавлялось еще 10%. Как показывает анализ полученных результатов достоверной разницы ни по
