осмотическое давление в экстрацеллюлярной среде и таким образом влияет на проникновение воды в клетку. Суть этого влияния заключается в том, что с понижением концентрации проникающего криопротектора с одновременным добавлением не проникающей сахарозы на экстрацеллюлярной стороне возникает противодавление, в результате чего во время быстрого удаления криопротектора в средах со сбалансированной концентрацией обоих криопротекторов осмотическая нагрузка на клетку остается более равномерной. Таким образом, удаление криопротектора с помощью сахарозы предотвращает осмотический шок /198,255,258/.
Кроме этого, по данным Borland R. /127/ и Kasai M. /185/, это оказывает положительное влияние на обмен веществ в клетке. С использованием сахарозы был разработан способ одноступенчатого замораживания и оттаивания эмбрионов /219, 202, 206/. В отличие от традиционного метода в пайетту помимо эмбриона с проникающим криопротектором заранее заправляется сахароза в определенной концентрации (1,0-1,5М), которая отделена от криопротектора с обеих сторон столбиком воздуха.
На первых этапах исследований по отработке режимов замораживания и оттаивания с применением сахарозы многие авторы применяли сахарозу в различной концентрации. Так, Leibo S. /201/ использовал изоосмолярную среду, в которой осмотическое давление на поверхность мембраны составляет 0. Эмбрионы в такой среде с выходом криопротектора сжимаются с последующим набуханием до первоначальной величины. При использовании сахарозы в гипоосмолярной концентрации наблюдалось первоначальное набухание эмбрионов с последующим сжатием. Однако, набухание эмбрионов, по данным Leibo S.P. /199/, не имеет негативного влияния на результаты приживляемости, если оно не превышает в 2,73 раза его первоначального объема.
Renard J.P. et. al. /237/, получили 40%-ю приживляемость эмбрионов в результате одноступенчатого замораживанияоттаивания (One-Step-metod) с применением гипоосмолярной
концентрации сахарозы. В опытах MassipA. et. al. /211/ проводилось одноступенчатое удаление криозащитной среды у эмбрионов, замороженных в 1М глицерине с 0,25 и 0,50 М средой сахарозы. При культивировании in vitro жизнеспособность таких эмбрионов составляла 12,5%, что намного ниже по сравнению с эмбрионами, оттаянными в 1М среде сахарозы (60,5%). Niemann H. /224/ в своих исследованиях также установил, что на жизнеспособность эмбрионов, у которых удаление криофилактиков проводилось с сахарозой, влияет ее концентрация, время воздействия и температура.
Рядом авторов /182, 200, 237/ проведены исследования по изучению воздействия объема глицерина и сахарозы внутри пайетты, а также режима оттаивания на приживляемость эмбрионов. Анализ полученных результатов показал, что приживляемость эмбрионов, оттаянных при 25 ° С в глицериновосахарозной среде при их соотношении 1/3 : 2/3 и 1 : 1, составила 42,3% и 19,9%, соответственно. Во втором опыте эмбрионы оттаивались при 37 ° С при соотношении глицерин-сахароза как 1/3 : 2/3 ; 1 : 1 и 1/10 : 9/10. Процент стельности в этом случае составил 52,9%; 20% и 31,3%, соответственно /331/.
Аналогичные исследования проводил и Lange H. /194/, который использовал 0,25М, 0,5М, 0,75М и 0,9М сахарозу. Приживляемость эмбрионов после оттаивания и пересадки составила 48,4%, 50,9%, 44,4% и 35,7%, соответственно.
В 1992 году Voelkel S. et. al. /265/ разработали метод криоконсервирования эмбрионоав на основе использования в качестве криопротектора этиленгликоля.
Как было установлено Szell А. et. al. /258/ этиленгликоль для эмбрионов крупного рогатого скота является менее токсичным, чем глицерин, и не так губительно действует на мембраны клеток. При этом он быстро проникает и выводится из клеток, что позволяет проводить пересадку эмбрионов без предварительного выведения криозащитной среды и повторного контроля эмбрионов. Некоторые из авторов сообщают о том, что использование этого криопротектора позволяет получить 60%
приживляемости, что соответствует приживляемости свежих эмбрионов.
Эмбрионы эквилибрируют в течение 10…20 мин. при комнатной температуре в этиленгликоле на основе ФБС, затем совместно со средой для культивирования заправляют в пайетту. При этом эмбрион в этиленгликоле отделяется от культуральной среды двумя пузырьками воздуха. После эквилибрации пайетту помещают в устройство для замораживания с температурой - 6 ° С. Кристаллизацию индуцируют непосредственно после помещения в замораживатель /202/ или через 3 мин. /193/ с последующей 3…5 минутной выдержкой. Охлаждение идет со скоростью 0,3 ° С/мин. до -33 ° С и последующим погружением в азот.
Ряд авторов предлагает другие режимы замораживания. Так, Janowitz U. et. al. /203, 184/ предлагают охлаждение эмбрионов проводить со скоростью 0,5 ° С/мин. до -35,2 ° С. Leibo S. /201/ начинают замораживание с -7 ° С при скорости охлаждения 0,6 ° С до -35 ° С. Оттаивание пайетт при этом проводится 5…10 сек на воздухе (при комнатной температуре), а затем в водяной бане при 30-38 ° С в течение 20-25 сек., что соответствует скорости оттаивания примерно 8000 ° С/мин.
Выведение криопротектора проводится смешиванием сред путем встряхивания пайетты непосредственно после ее оттаивания.
Voelkel S. /265/ провел ряд опытов по изучению эффективности использования ряда криопротекторов, в результате которых приживляемость эмбрионов, замороженных с использованием этиленгликоля, составила 75%, что значительно превышает результативность эмбрионов, замороженных с применением традиционных криофилатиков (глицерин, ДМСО). Это позволяет сделать вывод о том, что этиленгликоль в связи с его высокой термостабильностью является эффективным средством при замораживании зародышей. Однако есть и другие мнения. Так, Hasler J. et. al. /169/ критически оценивают результаты метода с применением
