Рисунок 94

Атипичная бластоциста

(7 д)

• эмбриобласт неправильной

• формы;

образованная

• неправильно

• бластополость /1/;

• многослойный трофобласт.

• Эмбрион хорошего качества , пригодный для

• трансплантации

Рисунок 95

• Полностью экспандированная бластоциста /1/, рядом с

• бластоцистой вышедшей из зоны пеллюцида /2/ (7-10 д)

• эмбриобласт локализован и

• имеет четкие границы (указаны стрелкой 1 и 2).

Рисунок - 96

Эмбрионы на разных стадиях развития(8 д)

1. Поздняя морула;

2. Ранняя бластоциста;

3. Поздняя бластоциста;

4. Полностью;

• экспандированная бластоциста

5. Полностью экспандированная бластоциста.

ГЛАВА 8. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ

Замораживание и оттаивание живых клеток представляет собой комплексный физико-химический процесс, регулируемый тепло- и водообменом между клеткой и окружающей ее средой, в течение которого жидкая фаза биообъектов переходит в твердую и наоборот /327, 333/.

Жизнеспособность клеток при охлаждении и замораживании зависит от ряда факторов, таких, например, как скорость охлаждения, поверхностно-объемное отношение, проницаемость клеточных мембран, температурные коэффициенты проницаемости /212, 237, 274/.

Для более полного понимания механизма замораживания и оттаивания эмбрионов остановимся на некоторых термодинамических процессах, происходящих в клетке в этот период.

Известно, что только 20% клеточной субстанции находится в твердом состоянии, все остальные клеточные компоненты находятся в водном растворе, находящемся в равновесии с окружающей средой. Поэтому, если обыкновенная вода замерзает при 0 ° С, то присутствие в клеточной субстанции ионов растворенных в ней солей, при отрицательных температурах близких к 0 ° С, понижает точку замерзания, т.е. раствор охлаждается ниже точки своего замерзания без образования льда.

При дальнейшем охлаждении происходит спонтанное образование центров кристаллизации, сопровождающееся нарастанием фронта кристаллизации и резким повышением температуры, поскольку изменение агрегатического состояния меняет накопленную между частичками клетки тепловую энергию, которая в зависимости от образования кристаллов или их оттаивания соответственно отдается или поглощается /200/.

При образовании кристаллов часть воды вымораживается, а концентрация веществ в растворе повышается, что ведет к дестабилизации осмотического равновесия. На эти изменения

клетка отвечает осмотической реакцией, т.е. отдачей воды в экзоцеллюлярную среду для выравнивания осмоса с последующим образованием интроцеллюлярного льда /199, 197/. Однако, с отдачей клеткой воды во внешнюю среду, повышается концентрация солей в самой клетке, и поэтому, от того, с какой скоростью клетка отдает или поглощает воду, во многом зависит сохранность клеточных структур и даже самой клетки во время криоконсервации /235/.

Медленное охлаждение дает клеткам возможность довольно быстро отдавать воду и таким образом поддерживать осмотическое равновесие. Но следует отметить тот факт, что при слишком низкой скорости охлаждения клетка теряет воду чрезвычайно быстро. При этом во внеклеточной среде образуются кристаллы, а эмбрион по причине длительного нахождения в растворе с повышенной концентрацией веществ обезвоживается, что служит причиной повреждения внутриклеточных структур и гибели эмбриона.

При слишком высокой скорости охлаждения, наоборот, вода не успевает своевременно уходить из клетки, и кристаллы образуются уже в клетке, что также приводит к ее гибели /213/.

Таким образом, как слишком медленное, так и слишком быстрое охлаждение служит причиной гибели зародышей. В первом случае – из-за обезвоживания, во втором – из-за внутриклеточного образования льда /211, 358/.

Для исключения невосстановимых криоповреждений и гибели клеток необходимо концентрационные и температурные изменения отрегулировать на осмотическое равновесие эмбриона.

Отрицательное влияние рассмотренных выше факторов при криоконсервировании клеток можно снизить путем применения криопротекторов и оптимальной скорости охлаждения. Однако, криопротекторы, хотя и обладают свойством предохранения клеток и тканей от возможных негативных воздействий при замораживании и оттаивании, могут и сами повреждать клетки эмбриона посредством осмотических изменений /270/.