Клетки, помещенные в среду, не имеющую проникающих криофилактиков в повышенной концентрации и не проникающих в нейтральной концентрации, реагируют на повышение осмолярности. Реакция, заключающаяся в изменении объема клеток и цитоплазматической воды, зависит от пропускной способности клеток для воды и криопротекторов, температуры и времени /157, 194/. При этом возможны следующие варианты:
-
Мембраны клеток не в состоянии пропустить криопротектор, в результате клетка сжимается до осмотического равновесия;
-
Пропускная способность мембран для воды выше, чем для криофилактика. В этом случае клетка сжимается до определенной величины с последующим набуханием до осмотического равновесия ;
-
Одинаковая пропускная способность для воды и криопротектора. В данном случае клеточная масса несколько увеличивается; 4. Пропускная способность для криопротектора выше, чем для воды, в результате чего клетка увеличивается до максимума с последующим уменьшением до новой величины осмотического равновесия.
Таким образом, во всех случаях, кроме первого, эндоцеллюлярная и экзоцеллюлярная концентрация криопротектора с течением времени достигает осмотического равновесия, а объем клеточной массы, из-за наличия в клетке проникающего криопротектора, становится больше /272/.
Достижение эмбрионом первоначального объема говорит об окончании химической эквилибрации, которая по данным некоторых исследователей /183, 185/ должна составлять 10…15 мин. При недостаточном насыщении клеток криопротектором эмбрионы во время замораживания могут получить криоповреждения, связанные с недостатком криозащиты.
По характеру действия различают два типа криопротекторов: проникающие и непроникающие в клетку. К первой группе относятся глицерин, диметилсульфоксид
(ДМСО), пропандиол, этиленгликоль. Для этих криопротекторов характерны высокая растворимость при больших концентрациях, а низкая молекулярная масса обусловливает их проникновение в клетку. Ко второй группе относятся сахароза, глюкоза, поливинилпирролидон и другие сахара, высокая молекулярная масса которых не позволяет им проникать в клетку.
Проникающие в клетку криопротекторы могут подразделяться в зависимости от типа клеток и состава окружающей среды на структурирующие и деструктурирующие воду, что способствует проникновению криофилактиков в клетку. Защитное действие криопротектора начинается только после его полного проникновения в клетку в мультимолярной концентрации и химической эквилибрации /182, 201/.
Эмбрион представляет собой клеточное соединение отдельных бластомеров, окруженных блестящей оболочкой (зоной пелюцида), которая выполняет защитную роль.
Проникающие криопротекторы проходят через зону пеллюцида в переветелиновое пространство. Одновременно вода начинает выходить из клетки во внеклеточное пространство до тех пор, пока между клеткой и внеклеточной средой не устанавливается осмотическое равновесие. Следовательно, глицерин способствует обезвоживанию эмбриональных клеток, замещая в них воду и восстанавливая тем самым их изотонический объем.
Mazur P. et al. /212, 213/ рассчитали, что для эмбрионов, которые теряют 90% первоначального объема воды до достижения температурной зоны образования льда, вероятность повреждения клеточных структур в связи с образованием эндоцеллюлярных кристаллов очень низка, тогда как тридцатипроцентный остаток первоначального объема воды приводит к внутриклеточному замерзанию. Кроме этого растворы криофилактиков (глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО), понижая точку замерзания криозащитной среды и тем самым, повышая ее вязкость, влияют на кристаллообразование: задерживают начало кристаллобразования, замедляют рост
кристаллов, способствуют стекловидному замерзанию даже при медленном охлаждении /183/.
Однако, как установили Niemann H. et. al. /224/, Rall W. /234, 235/ длительное воздействие высокой концентрации криопротектора, оказывает на эмбрион высокотоксичное действие. Необходимо также отметить, что эмбрионы разных видов животных на разных стадиях развития имеют различные криосвойства. Так, Whittigham D. /268, 269/ в своих исследованиях установил, что для криоконсервации морул и ранних бластоцист лучше всего использовать 1,5М раствор ДМСО на фосфатно-буферном растворе Дюльбекко или 1,0…1,4М раствор глицерина. Однако, по данным Bilton R. /126/ хотя 1,0М глицерин и 1,5М ДМСО обладают почти одинаковым криозащитным свойством, ДМСО является более токсичным для клеток.
Как правило, для замораживания 7…8 дневных эмбрионов крупного рогатого скота общепринятым криопротектором является глицерин, приготовленный на фосфатно-буферном солевом растворе с добавлением 20% фетальной сыворотки крови теленка.
Однако его существенным недостатком являются большие затраты времени, которые слагаются из времени на многоступенчатое насыщение эмбриона криопротектором, выдержке после сидинга, времени охлаждения до -350С, что в общей сложности составляет от 1,5…2 до 3 часов. При этом необходимо учитывать и время, необходимое на оттаивание эмбриона и выведение из него криопротектора, потому что аналогично насыщению удаление криопротектора также необходимо проводить многоступенчато, поскольку быстрое, неконтролируемое насыщение клеток водой вызывает их шок, вызванный разрывом бластомеров и лизисом клеток.
Whittinham D.G., et. al. /269/ предлагал заменить постепенное удаление криопротектора на введение в клетку изотонической среды малыми порциями в короткие промежутки времени. Однако и этот способ требует дополнительных затрат
