времени (трех-пяти ступенчатая проводка с 5…10 мин. эквилибрации в каждом растворе).
В связи с этим исследования последних лет были направлены на поиски методов, ускоряющих и упрощающих процесс замораживания зародышей, а также повышающих их выживаемость. Результаты исследований позволили разработать способ одноступенчатого насыщения эмбрионов криопротектором, что значительно упростило и ускорило процесс криоконсервирования при высоком (60%) уровне приживляемости /146/.
Данные исследования были подтверждены последующими работами. Так, Niemann H. et. al. /224/, помещал эмбрионы непосредственно в конечную концентрацию глицерина (1,4М). После оттаивания доля морфологически интактных эмбрионов составила в опытной группе 95,3% без существенных различий между стадиями. В контроле этот показатель составил 83%. При этом количество бластоцист хорошего качества было намного выше количества качественных морул (89% против 68,9% при Р>0,05). Доля эмбрионов с повреждением зоны пеллюцида в опытной группе составляла 26,6% по отношению к 13,2% в контроле. Зародышей с выделенными бластомерами было примерно одинаковое количество. Уровень стельности во второй группе составил 40,5% по сравнению с 51% в опыте. Высокий процент стельности был получен и при пересадке эмбрионов с поврежденной зоной пеллюцида: в обеих группах он составил 66,7%. Аналогичные результаты были получены после пересадки эмбрионов с выделенными бластомерами (52,9%).
Таким образом одноступенчатый метод насыщения эмбрионов криопротектором также позволяет получать достаточно высокие результаты.
Криопротекторы, не обладающие способностью проникать в клетки, являются высокополимерными углеводами и выполняют защитную роль в экстрацеллюлярной фазе в минимальной концентрации 0,01-0,2 М, что обеспечивает их низкую токсичность. Одним из таких криопротекторов является сахароза, которая в определенной концентрации повышает
осмотическое давление в экстрацеллюлярной среде и таким образом влияет на проникновение воды в клетку. Суть этого влияния заключается в том, что с понижением концентрации проникающего криопротектора с одновременным добавлением не проникающей сахарозы на экстрацеллюлярной стороне возникает противодавление, в результате чего во время быстрого удаления криопротектора в средах со сбалансированной концентрацией обоих криопротекторов осмотическая нагрузка на клетку остается более равномерной. Таким образом, удаление криопротектора с помощью сахарозы предотвращает осмотический шок /198,255,258/.
Кроме этого, по данным Borland R. /127/ и Kasai M. /185/, это оказывает положительное влияние на обмен веществ в клетке. С использованием сахарозы был разработан способ одноступенчатого замораживания и оттаивания эмбрионов /219, 202, 206/. В отличие от традиционного метода в пайетту помимо эмбриона с проникающим криопротектором заранее заправляется сахароза в определенной концентрации (1,0-1,5М), которая отделена от криопротектора с обеих сторон столбиком воздуха.
На первых этапах исследований по отработке режимов замораживания и оттаивания с применением сахарозы многие авторы применяли сахарозу в различной концентрации. Так, Leibo S. /201/ использовал изоосмолярную среду, в которой осмотическое давление на поверхность мембраны составляет 0. Эмбрионы в такой среде с выходом криопротектора сжимаются с последующим набуханием до первоначальной величины. При использовании сахарозы в гипоосмолярной концентрации наблюдалось первоначальное набухание эмбрионов с последующим сжатием. Однако, набухание эмбрионов, по данным Leibo S.P. /199/, не имеет негативного влияния на результаты приживляемости, если оно не превышает в 2,73 раза его первоначального объема.
Renard J.P. et. al. /237/, получили 40%-ю приживляемость эмбрионов в результате одноступенчатого замораживанияоттаивания (One-Step-metod) с применением гипоосмолярной
концентрации сахарозы. В опытах MassipA. et. al. /211/ проводилось одноступенчатое удаление криозащитной среды у эмбрионов, замороженных в 1М глицерине с 0,25 и 0,50 М средой сахарозы. При культивировании in vitro жизнеспособность таких эмбрионов составляла 12,5%, что намного ниже по сравнению с эмбрионами, оттаянными в 1М среде сахарозы (60,5%). Niemann H. /224/ в своих исследованиях также установил, что на жизнеспособность эмбрионов, у которых удаление криофилактиков проводилось с сахарозой, влияет ее концентрация, время воздействия и температура.
Рядом авторов /182, 200, 237/ проведены исследования по изучению воздействия объема глицерина и сахарозы внутри пайетты, а также режима оттаивания на приживляемость эмбрионов. Анализ полученных результатов показал, что приживляемость эмбрионов, оттаянных при 25 ° С в глицериновосахарозной среде при их соотношении 1/3 : 2/3 и 1 : 1, составила 42,3% и 19,9%, соответственно. Во втором опыте эмбрионы оттаивались при 37 ° С при соотношении глицерин-сахароза как 1/3 : 2/3 ; 1 : 1 и 1/10 : 9/10. Процент стельности в этом случае составил 52,9%; 20% и 31,3%, соответственно /331/.
Аналогичные исследования проводил и Lange H. /194/, который использовал 0,25М, 0,5М, 0,75М и 0,9М сахарозу. Приживляемость эмбрионов после оттаивания и пересадки составила 48,4%, 50,9%, 44,4% и 35,7%, соответственно.
В 1992 году Voelkel S. et. al. /265/ разработали метод криоконсервирования эмбрионоав на основе использования в качестве криопротектора этиленгликоля.
Как было установлено Szell А. et. al. /258/ этиленгликоль для эмбрионов крупного рогатого скота является менее токсичным, чем глицерин, и не так губительно действует на мембраны клеток. При этом он быстро проникает и выводится из клеток, что позволяет проводить пересадку эмбрионов без предварительного выведения криозащитной среды и повторного контроля эмбрионов. Некоторые из авторов сообщают о том, что использование этого криопротектора позволяет получить 60%
