приживляемости, что соответствует приживляемости свежих эмбрионов.
Эмбрионы эквилибрируют в течение 10…20 мин. при комнатной температуре в этиленгликоле на основе ФБС, затем совместно со средой для культивирования заправляют в пайетту. При этом эмбрион в этиленгликоле отделяется от культуральной среды двумя пузырьками воздуха. После эквилибрации пайетту помещают в устройство для замораживания с температурой - 6 ° С. Кристаллизацию индуцируют непосредственно после помещения в замораживатель /202/ или через 3 мин. /193/ с последующей 3…5 минутной выдержкой. Охлаждение идет со скоростью 0,3 ° С/мин. до -33 ° С и последующим погружением в азот.
Ряд авторов предлагает другие режимы замораживания. Так, Janowitz U. et. al. /203, 184/ предлагают охлаждение эмбрионов проводить со скоростью 0,5 ° С/мин. до -35,2 ° С. Leibo S. /201/ начинают замораживание с -7 ° С при скорости охлаждения 0,6 ° С до -35 ° С. Оттаивание пайетт при этом проводится 5…10 сек на воздухе (при комнатной температуре), а затем в водяной бане при 30-38 ° С в течение 20-25 сек., что соответствует скорости оттаивания примерно 8000 ° С/мин.
Выведение криопротектора проводится смешиванием сред путем встряхивания пайетты непосредственно после ее оттаивания.
Voelkel S. /265/ провел ряд опытов по изучению эффективности использования ряда криопротекторов, в результате которых приживляемость эмбрионов, замороженных с использованием этиленгликоля, составила 75%, что значительно превышает результативность эмбрионов, замороженных с применением традиционных криофилатиков (глицерин, ДМСО). Это позволяет сделать вывод о том, что этиленгликоль в связи с его высокой термостабильностью является эффективным средством при замораживании зародышей. Однако есть и другие мнения. Так, Hasler J. et. al. /169/ критически оценивают результаты метода с применением
этиленгликоля. По их мнению, глицерин имеет более щадящее воздействие на эмбрионы коров, чем этиленгликоль. Прежде чем делать такие выводы авторы провели ряд сравнительных исследований с 7-дневными эмбрионами. Время эквилибрации эмбрионов в этиленгликоле варьировало от 10 до 40 мин. при 25 ° С ± 2 ° С. Программа замораживания начиналась с -6 ° С, сидинг проводился в тот же момент. После 15 мин. выдержки после сидинга начиналось охлаждение со скоростью 0,6 ° С/мин. до -32,5 ° С. оттаивание проводилось в водяной бане при 36-38 ° С до полного растворения кристаллов. Перед постановкой на культивирование эмбрионы четыре раза отмывались в ФСБ с 10% фетальной сыворотки.
Эмбрионы, криоконсервированные в глицерине, оттаивали при такой же температуре с последующей проводкой в глицерине с сахарозой и отмыванием в ФСБ с 10% фетальной сыворотки.
Культивирование оттаянных эмбрионов (как одних, так и других) проводили в среде B2-BRL в течение 72 часов. Влияние криофилактика на жизнеспособность оценивалось в зависимости от развития морул до стадии бластоцисты и по числу вышедших из зоны пеллюцида экспандированных бластоцист.
Авторы пришли к выводу, что время выдержки в криофилактике и его тип не оказывают негативного влияния на выживаемость и первоначальное развитие в культуральной среде. Однако, было установлено достоверное снижение в развитии морул до бластоцист, замороженных в этиленгликоле – 68%, по сравнению с морулами, замороженными в глицерине – 77% (351/455). При этом авторы отмечают, что эмбрионы, полученные in vitro, будут вести себя, по всей видимости, иначе.
Аналогичный опыт был проведен и Looney C. et. al. /206/ на эмбрионах коров, полученных in vivo. В первом случае эмбрионы замораживались в 10% глицерине и 1,5М этиленгликоле. Во втором сравнивалась результативность замораживания эмбрионов в 1,5М и 1,35М этиленгликоле с 0,1М раствором сахарозы. В первом эксперименте результаты с
использованием 10% глицерина достоверно (Р<0,005) выше результатов с использованием 1,5М этиленгликоля (69,6 и 50%; 57,3 и 43,9%, соответственно). Во втором опыте достоверных различий не отмечено (41,5 и 40% соответственно).
Lange H. /193/, сравнивая два этих метода, отмечает преимущество использования этиленгликоля по следующим параметрам: сравнительно высокая приживляемость (58,6%), экономия до 20 минут времени на каждом эмбрионе, снижение количества оборудования и материалов.
Как говорилось выше, а также показали последующие исследования, эмбрионы, полученные in vitro, оказались более чувствительными к охлаждению и замораживанию по сравнению с эмбрионами, полученными in vivo /274, 185/. По данным Leibo S. /202/ ответственны за это липиды, влияющие на чувствительность клетки. Diez O. et. al. /145/ исследовали роль липидов в криоконсервировании эмбрионов, полученных in vitro. Они установили, что удаление эндоцеллюлярных липидов из зиготы не повлияло на результаты криоконсервации.
Исследователи под руководством Aoyagi Y. /118/ провели опыты по изучению влияния на эффективность криоконсервирования 7-дневных in vivo и in vitro полученных эмбрионов насыщенного липидами раствора сывороточного альбумина крупного рогатого скота Альбумакса (Alubumax) ТМ1 на основе 4%-й среды РСА фракции 5. В качестве криопротекторов использовались 4%-й этиленгликоль и 0,3М сахароза. Для определения выживаемости эмбрионы культивировали при 39 ° С в течение 48 часов в присутствии 5% СО2. Оценка проводилась по наличию реэкспандированных и вышедших из зоны пеллюцида бластоцист. В полученных результатах не было зафиксировано достоверного различия. Хотя установлена четкая тенденция повышения эффективности криоконсервации с использованием Alubumax. Так, из 35 эмбрионов in vitro, замороженных с сывороточным альбумином, сохранилось 30, что составило 86%. У эмбрионов in vivo была зарегистрирована 100% выживаемость (34 из 34). Количество
