бластоцист, вышедших из зоны пеллюцида, в первом случае составило 43%, во втором – 71%.
Эти выводы подтверждаются и вторым опытом: замороженные в этиленгликоле с добавлением Albumaxa эмбрионы были оттаяны и пересажены синхронизированным телкам разного возраста. Так же, как и в первом опыте, достоверных различий отмечено не было (55%-я приживляемость у эмбрионов, полученных in vitro и 61%-я у эмбрионов, полученных in vivo), хотя прежняя тенденция сохранилась.
Таким образом, несмотря на достаточно обширный материал научных исследований по данной теме, до настоящего времени нет единого мнения о применении этиленгликоля при консервировании эмбрионов крупного рогатого скота, что и определило одно из направлений наших исследований.
Как говорилось выше, при достижении точки замерзания среды она, как правило, замерзает не сразу. Происходит некоторое переохлаждение, обусловленное отсутствием в среде кристаллизационных центров. Лишь при охлаждении на несколько градусов ниже точки замерзания начинается спонтанное образование кристаллов. При этом спонтанная нуклеация (образование центров кристаллизации) будет возникать случайно и зависеть от объема и температуры образца.
По данным Diller K. /146/ фаза переохлаждения, так называемого "суперкулинга", в процессе криоконсервации негативно влияет на выделение воды из клеток, что ведет к образованию кристаллов, губительно действующих на мембраны бластомеров. В переохлажденной до -15 ° С клетке находится объем воды, равный объему при 0 ° С. В клетке, находящейся в частично замороженной среде, при такой же температуре воды наполовину меньше /149, 200/. Это связано с тем, что, с одной стороны, фаза переохлаждения сокращает разницу температуры между экстроцеллюлярным и интроцеллюлярным образованием льда, что сокращает время отдачи клеткой воды и сжатия, с другой стороны, с понижением температуры снижается
(изменяется) коэффициент пропускной способности мембран клетки для воды.
В настоящее время все применяемые на практике процедуры замораживания эмбрионов предусматривают введение затравки для индуцирования процесса льдообразования в переохлажденном растворе с эмбрионами. Цель внесения затравки – это выведение переохлажденного раствора с эмбрионами из метастабильного состояния и стимуляция образования льда при контролируемых условиях.
Искусственное индуцирование образования льда за 1-2 ° С до спонтанной кристаллизации предотвращает переохлаждение экстрацеллюлярной среды до минимума, способствует оптимальному протеканию осмотической реакции и играет важную роль для выживаемости зародышей.
Оптимальное время индуцирования кристаллизации зависит от типа и концентрации криопротектора /329/. В результате многочисленных исследований по определению температуры сидинга Wiladsen S.M. /271/ определил, что индуцирование кристаллизации при минус 0-7,10 ° С не имеет негативного влияния на выживаемость эмбрионов.
Работы Bilton R., Moore N. /126, 218/, Trounson A. et. al. /263/, а также Willadsen S. /272/ подтвердили мнение о том, что сидинг должен быть проведен как можно ближе к точке спонтанного образования льда в среде для замораживания биообъектов.
Эксперименты Whittingham D. et. al. /269/ показали, что внесение затравки при температурах -5 ° С или -12 ° С не вызывает повреждения эмбрионов. Однако, в первом случае из охлажденных в дальнейшем до -1960С эмбрионов выживает значительно большая часть, а во втором – меньшая. Дело в том, что внесение затравки определяет разовый переход раствора из жидкого состояния в твердое, и в первом случае концентрация глицерина (1,5М) резко возрастает до 5М, во втором случае – до 10М. Таким образом, в первом случае создаются условия оптимального обезвоживания клетки, во втором – осмотическое
воздействие будет значительно более жесткое, что обусловливает повреждение клетки при дальнейшем охлаждении.
Одним из важнейших факторов выживаемости эмбрионов, как отмечает Diller K. /146/, является длительность выдержки между индуцированием кристаллизации и началом дальнейшего понижения температуры. Этот период времени способствует эквилибрации клетки, обеспечивает возможность оптимального выделения воды и предотвращает криоповреждение клетки. Однако, он не рекомендует чрезмерно длительную эквилибрацию, объясняя это тем, что незамороженная клетка имеет при этом длительный контакт со средой с высокой концентрацией солей. Niemann H. /224/ предлагает время выдержки 5-10 мин.
В результате криоконсервации около 15-20% эмбрионов коров становятся непригодными для трансплантации, а у оставшихся приживляемость после пересадки снижается. Поэтому представляется важным определить факторы, оказывающие наиболее сильное влияние на жизнеспособность замороженно-оттаянных эмбрионов /95, 274/.
Так, Нетеча В. и др. /61/ установили, что эмбрионы отличного и хорошего качества более успешно переносили условия замораживания и оттаивания в отличие от зародышей удовлетворительного качества. Похожие результаты были получены в исследованиях Смысловой Н. и др. /95/, у которых эмбрионы отличного и хорошего качества после оттаивания и пересадки дали 50% приживляемости. Ряд других исследователей /72/ при пересадке хороших и отличных эмбрионов получили 44 и 46% стельностей против 22,6 и 37% при пересадке удовлетворительных и условно пригодных. Адекватные результаты получены Мадисоном В. и др. /54/, которые отмечают необходимость более тщательного отбора эмбрионов по качеству для замораживания. Однако, как отмечают авторы, анализ результатов сохранности эмбрионами своего качества показывает, что эмбрионы отличного качества сохранили оценку "отлично" после оттаивания только в 14,3%
