кристаллов, способствуют стекловидному замерзанию даже при медленном охлаждении /183/.
Однако, как установили Niemann H. et. al. /224/, Rall W. /234, 235/ длительное воздействие высокой концентрации криопротектора, оказывает на эмбрион высокотоксичное действие. Необходимо также отметить, что эмбрионы разных видов животных на разных стадиях развития имеют различные криосвойства. Так, Whittigham D. /268, 269/ в своих исследованиях установил, что для криоконсервации морул и ранних бластоцист лучше всего использовать 1,5М раствор ДМСО на фосфатно-буферном растворе Дюльбекко или 1,0…1,4М раствор глицерина. Однако, по данным Bilton R. /126/ хотя 1,0М глицерин и 1,5М ДМСО обладают почти одинаковым криозащитным свойством, ДМСО является более токсичным для клеток.
Как правило, для замораживания 7…8 дневных эмбрионов крупного рогатого скота общепринятым криопротектором является глицерин, приготовленный на фосфатно-буферном солевом растворе с добавлением 20% фетальной сыворотки крови теленка.
Однако его существенным недостатком являются большие затраты времени, которые слагаются из времени на многоступенчатое насыщение эмбриона криопротектором, выдержке после сидинга, времени охлаждения до -350С, что в общей сложности составляет от 1,5…2 до 3 часов. При этом необходимо учитывать и время, необходимое на оттаивание эмбриона и выведение из него криопротектора, потому что аналогично насыщению удаление криопротектора также необходимо проводить многоступенчато, поскольку быстрое, неконтролируемое насыщение клеток водой вызывает их шок, вызванный разрывом бластомеров и лизисом клеток.
Whittinham D.G., et. al. /269/ предлагал заменить постепенное удаление криопротектора на введение в клетку изотонической среды малыми порциями в короткие промежутки времени. Однако и этот способ требует дополнительных затрат
времени (трех-пяти ступенчатая проводка с 5…10 мин. эквилибрации в каждом растворе).
В связи с этим исследования последних лет были направлены на поиски методов, ускоряющих и упрощающих процесс замораживания зародышей, а также повышающих их выживаемость. Результаты исследований позволили разработать способ одноступенчатого насыщения эмбрионов криопротектором, что значительно упростило и ускорило процесс криоконсервирования при высоком (60%) уровне приживляемости /146/.
Данные исследования были подтверждены последующими работами. Так, Niemann H. et. al. /224/, помещал эмбрионы непосредственно в конечную концентрацию глицерина (1,4М). После оттаивания доля морфологически интактных эмбрионов составила в опытной группе 95,3% без существенных различий между стадиями. В контроле этот показатель составил 83%. При этом количество бластоцист хорошего качества было намного выше количества качественных морул (89% против 68,9% при Р>0,05). Доля эмбрионов с повреждением зоны пеллюцида в опытной группе составляла 26,6% по отношению к 13,2% в контроле. Зародышей с выделенными бластомерами было примерно одинаковое количество. Уровень стельности во второй группе составил 40,5% по сравнению с 51% в опыте. Высокий процент стельности был получен и при пересадке эмбрионов с поврежденной зоной пеллюцида: в обеих группах он составил 66,7%. Аналогичные результаты были получены после пересадки эмбрионов с выделенными бластомерами (52,9%).
Таким образом одноступенчатый метод насыщения эмбрионов криопротектором также позволяет получать достаточно высокие результаты.
Криопротекторы, не обладающие способностью проникать в клетки, являются высокополимерными углеводами и выполняют защитную роль в экстрацеллюлярной фазе в минимальной концентрации 0,01-0,2 М, что обеспечивает их низкую токсичность. Одним из таких криопротекторов является сахароза, которая в определенной концентрации повышает
осмотическое давление в экстрацеллюлярной среде и таким образом влияет на проникновение воды в клетку. Суть этого влияния заключается в том, что с понижением концентрации проникающего криопротектора с одновременным добавлением не проникающей сахарозы на экстрацеллюлярной стороне возникает противодавление, в результате чего во время быстрого удаления криопротектора в средах со сбалансированной концентрацией обоих криопротекторов осмотическая нагрузка на клетку остается более равномерной. Таким образом, удаление криопротектора с помощью сахарозы предотвращает осмотический шок /198,255,258/.
Кроме этого, по данным Borland R. /127/ и Kasai M. /185/, это оказывает положительное влияние на обмен веществ в клетке. С использованием сахарозы был разработан способ одноступенчатого замораживания и оттаивания эмбрионов /219, 202, 206/. В отличие от традиционного метода в пайетту помимо эмбриона с проникающим криопротектором заранее заправляется сахароза в определенной концентрации (1,0-1,5М), которая отделена от криопротектора с обеих сторон столбиком воздуха.
На первых этапах исследований по отработке режимов замораживания и оттаивания с применением сахарозы многие авторы применяли сахарозу в различной концентрации. Так, Leibo S. /201/ использовал изоосмолярную среду, в которой осмотическое давление на поверхность мембраны составляет 0. Эмбрионы в такой среде с выходом криопротектора сжимаются с последующим набуханием до первоначальной величины. При использовании сахарозы в гипоосмолярной концентрации наблюдалось первоначальное набухание эмбрионов с последующим сжатием. Однако, набухание эмбрионов, по данным Leibo S.P. /199/, не имеет негативного влияния на результаты приживляемости, если оно не превышает в 2,73 раза его первоначального объема.
Renard J.P. et. al. /237/, получили 40%-ю приживляемость эмбрионов в результате одноступенчатого замораживанияоттаивания (One-Step-metod) с применением гипоосмолярной
