концентрации сахарозы. В опытах MassipA. et. al. /211/ проводилось одноступенчатое удаление криозащитной среды у эмбрионов, замороженных в 1М глицерине с 0,25 и 0,50 М средой сахарозы. При культивировании in vitro жизнеспособность таких эмбрионов составляла 12,5%, что намного ниже по сравнению с эмбрионами, оттаянными в 1М среде сахарозы (60,5%). Niemann H. /224/ в своих исследованиях также установил, что на жизнеспособность эмбрионов, у которых удаление криофилактиков проводилось с сахарозой, влияет ее концентрация, время воздействия и температура.
Рядом авторов /182, 200, 237/ проведены исследования по изучению воздействия объема глицерина и сахарозы внутри пайетты, а также режима оттаивания на приживляемость эмбрионов. Анализ полученных результатов показал, что приживляемость эмбрионов, оттаянных при 25 ° С в глицериновосахарозной среде при их соотношении 1/3 : 2/3 и 1 : 1, составила 42,3% и 19,9%, соответственно. Во втором опыте эмбрионы оттаивались при 37 ° С при соотношении глицерин-сахароза как 1/3 : 2/3 ; 1 : 1 и 1/10 : 9/10. Процент стельности в этом случае составил 52,9%; 20% и 31,3%, соответственно /331/.
Аналогичные исследования проводил и Lange H. /194/, который использовал 0,25М, 0,5М, 0,75М и 0,9М сахарозу. Приживляемость эмбрионов после оттаивания и пересадки составила 48,4%, 50,9%, 44,4% и 35,7%, соответственно.
В 1992 году Voelkel S. et. al. /265/ разработали метод криоконсервирования эмбрионоав на основе использования в качестве криопротектора этиленгликоля.
Как было установлено Szell А. et. al. /258/ этиленгликоль для эмбрионов крупного рогатого скота является менее токсичным, чем глицерин, и не так губительно действует на мембраны клеток. При этом он быстро проникает и выводится из клеток, что позволяет проводить пересадку эмбрионов без предварительного выведения криозащитной среды и повторного контроля эмбрионов. Некоторые из авторов сообщают о том, что использование этого криопротектора позволяет получить 60%
приживляемости, что соответствует приживляемости свежих эмбрионов.
Эмбрионы эквилибрируют в течение 10…20 мин. при комнатной температуре в этиленгликоле на основе ФБС, затем совместно со средой для культивирования заправляют в пайетту. При этом эмбрион в этиленгликоле отделяется от культуральной среды двумя пузырьками воздуха. После эквилибрации пайетту помещают в устройство для замораживания с температурой - 6 ° С. Кристаллизацию индуцируют непосредственно после помещения в замораживатель /202/ или через 3 мин. /193/ с последующей 3…5 минутной выдержкой. Охлаждение идет со скоростью 0,3 ° С/мин. до -33 ° С и последующим погружением в азот.
Ряд авторов предлагает другие режимы замораживания. Так, Janowitz U. et. al. /203, 184/ предлагают охлаждение эмбрионов проводить со скоростью 0,5 ° С/мин. до -35,2 ° С. Leibo S. /201/ начинают замораживание с -7 ° С при скорости охлаждения 0,6 ° С до -35 ° С. Оттаивание пайетт при этом проводится 5…10 сек на воздухе (при комнатной температуре), а затем в водяной бане при 30-38 ° С в течение 20-25 сек., что соответствует скорости оттаивания примерно 8000 ° С/мин.
Выведение криопротектора проводится смешиванием сред путем встряхивания пайетты непосредственно после ее оттаивания.
Voelkel S. /265/ провел ряд опытов по изучению эффективности использования ряда криопротекторов, в результате которых приживляемость эмбрионов, замороженных с использованием этиленгликоля, составила 75%, что значительно превышает результативность эмбрионов, замороженных с применением традиционных криофилатиков (глицерин, ДМСО). Это позволяет сделать вывод о том, что этиленгликоль в связи с его высокой термостабильностью является эффективным средством при замораживании зародышей. Однако есть и другие мнения. Так, Hasler J. et. al. /169/ критически оценивают результаты метода с применением
этиленгликоля. По их мнению, глицерин имеет более щадящее воздействие на эмбрионы коров, чем этиленгликоль. Прежде чем делать такие выводы авторы провели ряд сравнительных исследований с 7-дневными эмбрионами. Время эквилибрации эмбрионов в этиленгликоле варьировало от 10 до 40 мин. при 25 ° С ± 2 ° С. Программа замораживания начиналась с -6 ° С, сидинг проводился в тот же момент. После 15 мин. выдержки после сидинга начиналось охлаждение со скоростью 0,6 ° С/мин. до -32,5 ° С. оттаивание проводилось в водяной бане при 36-38 ° С до полного растворения кристаллов. Перед постановкой на культивирование эмбрионы четыре раза отмывались в ФСБ с 10% фетальной сыворотки.
Эмбрионы, криоконсервированные в глицерине, оттаивали при такой же температуре с последующей проводкой в глицерине с сахарозой и отмыванием в ФСБ с 10% фетальной сыворотки.
Культивирование оттаянных эмбрионов (как одних, так и других) проводили в среде B2-BRL в течение 72 часов. Влияние криофилактика на жизнеспособность оценивалось в зависимости от развития морул до стадии бластоцисты и по числу вышедших из зоны пеллюцида экспандированных бластоцист.
Авторы пришли к выводу, что время выдержки в криофилактике и его тип не оказывают негативного влияния на выживаемость и первоначальное развитие в культуральной среде. Однако, было установлено достоверное снижение в развитии морул до бластоцист, замороженных в этиленгликоле – 68%, по сравнению с морулами, замороженными в глицерине – 77% (351/455). При этом авторы отмечают, что эмбрионы, полученные in vitro, будут вести себя, по всей видимости, иначе.
Аналогичный опыт был проведен и Looney C. et. al. /206/ на эмбрионах коров, полученных in vivo. В первом случае эмбрионы замораживались в 10% глицерине и 1,5М этиленгликоле. Во втором сравнивалась результативность замораживания эмбрионов в 1,5М и 1,35М этиленгликоле с 0,1М раствором сахарозы. В первом эксперименте результаты с
