использованием 10% глицерина достоверно (Р<0,005) выше результатов с использованием 1,5М этиленгликоля (69,6 и 50%; 57,3 и 43,9%, соответственно). Во втором опыте достоверных различий не отмечено (41,5 и 40% соответственно).
Lange H. /193/, сравнивая два этих метода, отмечает преимущество использования этиленгликоля по следующим параметрам: сравнительно высокая приживляемость (58,6%), экономия до 20 минут времени на каждом эмбрионе, снижение количества оборудования и материалов.
Как говорилось выше, а также показали последующие исследования, эмбрионы, полученные in vitro, оказались более чувствительными к охлаждению и замораживанию по сравнению с эмбрионами, полученными in vivo /274, 185/. По данным Leibo S. /202/ ответственны за это липиды, влияющие на чувствительность клетки. Diez O. et. al. /145/ исследовали роль липидов в криоконсервировании эмбрионов, полученных in vitro. Они установили, что удаление эндоцеллюлярных липидов из зиготы не повлияло на результаты криоконсервации.
Исследователи под руководством Aoyagi Y. /118/ провели опыты по изучению влияния на эффективность криоконсервирования 7-дневных in vivo и in vitro полученных эмбрионов насыщенного липидами раствора сывороточного альбумина крупного рогатого скота Альбумакса (Alubumax) ТМ1 на основе 4%-й среды РСА фракции 5. В качестве криопротекторов использовались 4%-й этиленгликоль и 0,3М сахароза. Для определения выживаемости эмбрионы культивировали при 39 ° С в течение 48 часов в присутствии 5% СО2. Оценка проводилась по наличию реэкспандированных и вышедших из зоны пеллюцида бластоцист. В полученных результатах не было зафиксировано достоверного различия. Хотя установлена четкая тенденция повышения эффективности криоконсервации с использованием Alubumax. Так, из 35 эмбрионов in vitro, замороженных с сывороточным альбумином, сохранилось 30, что составило 86%. У эмбрионов in vivo была зарегистрирована 100% выживаемость (34 из 34). Количество
бластоцист, вышедших из зоны пеллюцида, в первом случае составило 43%, во втором – 71%.
Эти выводы подтверждаются и вторым опытом: замороженные в этиленгликоле с добавлением Albumaxa эмбрионы были оттаяны и пересажены синхронизированным телкам разного возраста. Так же, как и в первом опыте, достоверных различий отмечено не было (55%-я приживляемость у эмбрионов, полученных in vitro и 61%-я у эмбрионов, полученных in vivo), хотя прежняя тенденция сохранилась.
Таким образом, несмотря на достаточно обширный материал научных исследований по данной теме, до настоящего времени нет единого мнения о применении этиленгликоля при консервировании эмбрионов крупного рогатого скота, что и определило одно из направлений наших исследований.
Как говорилось выше, при достижении точки замерзания среды она, как правило, замерзает не сразу. Происходит некоторое переохлаждение, обусловленное отсутствием в среде кристаллизационных центров. Лишь при охлаждении на несколько градусов ниже точки замерзания начинается спонтанное образование кристаллов. При этом спонтанная нуклеация (образование центров кристаллизации) будет возникать случайно и зависеть от объема и температуры образца.
По данным Diller K. /146/ фаза переохлаждения, так называемого "суперкулинга", в процессе криоконсервации негативно влияет на выделение воды из клеток, что ведет к образованию кристаллов, губительно действующих на мембраны бластомеров. В переохлажденной до -15 ° С клетке находится объем воды, равный объему при 0 ° С. В клетке, находящейся в частично замороженной среде, при такой же температуре воды наполовину меньше /149, 200/. Это связано с тем, что, с одной стороны, фаза переохлаждения сокращает разницу температуры между экстроцеллюлярным и интроцеллюлярным образованием льда, что сокращает время отдачи клеткой воды и сжатия, с другой стороны, с понижением температуры снижается
(изменяется) коэффициент пропускной способности мембран клетки для воды.
В настоящее время все применяемые на практике процедуры замораживания эмбрионов предусматривают введение затравки для индуцирования процесса льдообразования в переохлажденном растворе с эмбрионами. Цель внесения затравки – это выведение переохлажденного раствора с эмбрионами из метастабильного состояния и стимуляция образования льда при контролируемых условиях.
Искусственное индуцирование образования льда за 1-2 ° С до спонтанной кристаллизации предотвращает переохлаждение экстрацеллюлярной среды до минимума, способствует оптимальному протеканию осмотической реакции и играет важную роль для выживаемости зародышей.
Оптимальное время индуцирования кристаллизации зависит от типа и концентрации криопротектора /329/. В результате многочисленных исследований по определению температуры сидинга Wiladsen S.M. /271/ определил, что индуцирование кристаллизации при минус 0-7,10 ° С не имеет негативного влияния на выживаемость эмбрионов.
Работы Bilton R., Moore N. /126, 218/, Trounson A. et. al. /263/, а также Willadsen S. /272/ подтвердили мнение о том, что сидинг должен быть проведен как можно ближе к точке спонтанного образования льда в среде для замораживания биообъектов.
Эксперименты Whittingham D. et. al. /269/ показали, что внесение затравки при температурах -5 ° С или -12 ° С не вызывает повреждения эмбрионов. Однако, в первом случае из охлажденных в дальнейшем до -1960С эмбрионов выживает значительно большая часть, а во втором – меньшая. Дело в том, что внесение затравки определяет разовый переход раствора из жидкого состояния в твердое, и в первом случае концентрация глицерина (1,5М) резко возрастает до 5М, во втором случае – до 10М. Таким образом, в первом случае создаются условия оптимального обезвоживания клетки, во втором – осмотическое
