воздействие будет значительно более жесткое, что обусловливает повреждение клетки при дальнейшем охлаждении.
Одним из важнейших факторов выживаемости эмбрионов, как отмечает Diller K. /146/, является длительность выдержки между индуцированием кристаллизации и началом дальнейшего понижения температуры. Этот период времени способствует эквилибрации клетки, обеспечивает возможность оптимального выделения воды и предотвращает криоповреждение клетки. Однако, он не рекомендует чрезмерно длительную эквилибрацию, объясняя это тем, что незамороженная клетка имеет при этом длительный контакт со средой с высокой концентрацией солей. Niemann H. /224/ предлагает время выдержки 5-10 мин.
В результате криоконсервации около 15-20% эмбрионов коров становятся непригодными для трансплантации, а у оставшихся приживляемость после пересадки снижается. Поэтому представляется важным определить факторы, оказывающие наиболее сильное влияние на жизнеспособность замороженно-оттаянных эмбрионов /95, 274/.
Так, Нетеча В. и др. /61/ установили, что эмбрионы отличного и хорошего качества более успешно переносили условия замораживания и оттаивания в отличие от зародышей удовлетворительного качества. Похожие результаты были получены в исследованиях Смысловой Н. и др. /95/, у которых эмбрионы отличного и хорошего качества после оттаивания и пересадки дали 50% приживляемости. Ряд других исследователей /72/ при пересадке хороших и отличных эмбрионов получили 44 и 46% стельностей против 22,6 и 37% при пересадке удовлетворительных и условно пригодных. Адекватные результаты получены Мадисоном В. и др. /54/, которые отмечают необходимость более тщательного отбора эмбрионов по качеству для замораживания. Однако, как отмечают авторы, анализ результатов сохранности эмбрионами своего качества показывает, что эмбрионы отличного качества сохранили оценку "отлично" после оттаивания только в 14,3%
случаев, хорошие – в 22,1%, а удовлетворительные – в 41,4%. Доля эмбрионов отличного качества уменьшалась после оттаивания в 2,2 раза, а число зародышей удовлетворительного качества увеличивалось в 3 раза.
От пересадки эмбрионов отличного качества уровень стельности был в 1,4 раза выше, чем от пересадки эмбрионов удовлетворительного качества.
В центре трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота Всероссийского НИИ животноводства /54/ было заморожено 478 эмбрионов, сохранность которых составила 84%. При замораживании эмбрионов отличного и хорошего качества процент пригодных к пересадке эмбрионов составил 89,6%. Однако, отличные по качеству зародыши сохранили свой статус только в 15,4% случаев, в то время как 60% эмбрионов перешли в разряд хороших, а 19,2% дегенерировали. Заметно лучше переносили пониженные температуры эмбрионы, которые перед заморозкой были оценены как хорошие. Так, из 213 эмбрионов хорошего качества 51,2% сохранили после оттаивания свое качество. Одним из критериев оценки жизнеспособности зародышей является соответствие их возраста той стадии развития, на которой они находились во время извлечения.
В ряде исследований /95/ установлено, что у поздних бластоцист приживляемость была более высокой (41,7%) против 32% у морул и 39% ранних бластоцист. В исследованиях Frim, J. /157/ сохранность поздних бластоцист составила 100%. Ishida T. и др. /182/ отмечают, что более устойчивыми к криоконсервации являются хорошие бластоцисты, 85% которых сохранили свою жизнеспособность и дали 50% стельностей против 38% сохранившихся в хорошем состоянии морул. Мадисон В. и др. /54/ при заморозке ранних бластоцист получили 80,9% сохранности, морул – 77,3%.
Отмечается, что эмбрионы крупного рогатого скота и коз на стадии поздней морулы и ранней бластоцисты более пригодны для криоконсервации, чем экспандированные бластоцисты. После пересадки в первом случае получено 62,5%
стельностей по отношению к 52,9% во втором. В свою очередь, экспандированные бластоцисты на начальной стадии выхода из зоны пеллюцида также показали более высокий уровень сохранности, нежели экспандированные бластоцисты (23,8% против 21,9%). Эмбрионы крупного рогатого скота можно криоконсервировать и на более ранних стадиях развития так же, как и их половинки, помещенные в зону пеллюцида.
В своих более поздних исследованиях Смыслова Н. и др. /160/ указывают на то, что эмбрионы от поздней морулы до поздней бластоцисты одинаково выдерживают глубокое замораживание и стадия их развития не является критическим фактором для приживляемости эмбрионов.
В свою очередь Сергеев Н. и др. /90/, получивший более высокие показатели по сохранности ранних бластоцист, делает предположение о том, что более низкая выживаемость поздних морул объясняется наличием трех-четырех слоев клеток и плотным межклеточным контактом, что затрудняет проникновение криопротектора и выход воды. Образование бластоцели облегчает протекание обменных процессов и увеличивает криорезистентность эмбрионов на стадии ранней бластоцисты. Однако, с дальнейшим развитием зародыша количество клеток возрастает, межклеточные контакты в эмбриобласте увеличиваются, и транспорт веществ во внутренних слоях замедляется, что требует применения для криоконсервации эмбрионов поздних стадий таких же методов, как для криоконсервации тканевых структур.
Основополагающим фактором, оказывающим самое непосредственное влияние на сохранность и последующую приживляемость замороженно-оттаянных эмбрионов, является криопротектор. Как было сказано выше, криопротекторы можно разделить на две большие группы, проникающие в клетку (ДМСО, глицерин, этиленгликоль) и непроникающие (сахароза и ряд других сахаров).
Сравнительный анализ ДМСО (диметилсульфоксид) и глицерина показал, что при использовании первого у крупного рогатого скота получено 84,6% пригодных к пересадке
