(изменяется) коэффициент пропускной способности мембран клетки для воды.
В настоящее время все применяемые на практике процедуры замораживания эмбрионов предусматривают введение затравки для индуцирования процесса льдообразования в переохлажденном растворе с эмбрионами. Цель внесения затравки – это выведение переохлажденного раствора с эмбрионами из метастабильного состояния и стимуляция образования льда при контролируемых условиях.
Искусственное индуцирование образования льда за 1-2 ° С до спонтанной кристаллизации предотвращает переохлаждение экстрацеллюлярной среды до минимума, способствует оптимальному протеканию осмотической реакции и играет важную роль для выживаемости зародышей.
Оптимальное время индуцирования кристаллизации зависит от типа и концентрации криопротектора /329/. В результате многочисленных исследований по определению температуры сидинга Wiladsen S.M. /271/ определил, что индуцирование кристаллизации при минус 0-7,10 ° С не имеет негативного влияния на выживаемость эмбрионов.
Работы Bilton R., Moore N. /126, 218/, Trounson A. et. al. /263/, а также Willadsen S. /272/ подтвердили мнение о том, что сидинг должен быть проведен как можно ближе к точке спонтанного образования льда в среде для замораживания биообъектов.
Эксперименты Whittingham D. et. al. /269/ показали, что внесение затравки при температурах -5 ° С или -12 ° С не вызывает повреждения эмбрионов. Однако, в первом случае из охлажденных в дальнейшем до -1960С эмбрионов выживает значительно большая часть, а во втором – меньшая. Дело в том, что внесение затравки определяет разовый переход раствора из жидкого состояния в твердое, и в первом случае концентрация глицерина (1,5М) резко возрастает до 5М, во втором случае – до 10М. Таким образом, в первом случае создаются условия оптимального обезвоживания клетки, во втором – осмотическое
воздействие будет значительно более жесткое, что обусловливает повреждение клетки при дальнейшем охлаждении.
Одним из важнейших факторов выживаемости эмбрионов, как отмечает Diller K. /146/, является длительность выдержки между индуцированием кристаллизации и началом дальнейшего понижения температуры. Этот период времени способствует эквилибрации клетки, обеспечивает возможность оптимального выделения воды и предотвращает криоповреждение клетки. Однако, он не рекомендует чрезмерно длительную эквилибрацию, объясняя это тем, что незамороженная клетка имеет при этом длительный контакт со средой с высокой концентрацией солей. Niemann H. /224/ предлагает время выдержки 5-10 мин.
В результате криоконсервации около 15-20% эмбрионов коров становятся непригодными для трансплантации, а у оставшихся приживляемость после пересадки снижается. Поэтому представляется важным определить факторы, оказывающие наиболее сильное влияние на жизнеспособность замороженно-оттаянных эмбрионов /95, 274/.
Так, Нетеча В. и др. /61/ установили, что эмбрионы отличного и хорошего качества более успешно переносили условия замораживания и оттаивания в отличие от зародышей удовлетворительного качества. Похожие результаты были получены в исследованиях Смысловой Н. и др. /95/, у которых эмбрионы отличного и хорошего качества после оттаивания и пересадки дали 50% приживляемости. Ряд других исследователей /72/ при пересадке хороших и отличных эмбрионов получили 44 и 46% стельностей против 22,6 и 37% при пересадке удовлетворительных и условно пригодных. Адекватные результаты получены Мадисоном В. и др. /54/, которые отмечают необходимость более тщательного отбора эмбрионов по качеству для замораживания. Однако, как отмечают авторы, анализ результатов сохранности эмбрионами своего качества показывает, что эмбрионы отличного качества сохранили оценку "отлично" после оттаивания только в 14,3%
случаев, хорошие – в 22,1%, а удовлетворительные – в 41,4%. Доля эмбрионов отличного качества уменьшалась после оттаивания в 2,2 раза, а число зародышей удовлетворительного качества увеличивалось в 3 раза.
От пересадки эмбрионов отличного качества уровень стельности был в 1,4 раза выше, чем от пересадки эмбрионов удовлетворительного качества.
В центре трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота Всероссийского НИИ животноводства /54/ было заморожено 478 эмбрионов, сохранность которых составила 84%. При замораживании эмбрионов отличного и хорошего качества процент пригодных к пересадке эмбрионов составил 89,6%. Однако, отличные по качеству зародыши сохранили свой статус только в 15,4% случаев, в то время как 60% эмбрионов перешли в разряд хороших, а 19,2% дегенерировали. Заметно лучше переносили пониженные температуры эмбрионы, которые перед заморозкой были оценены как хорошие. Так, из 213 эмбрионов хорошего качества 51,2% сохранили после оттаивания свое качество. Одним из критериев оценки жизнеспособности зародышей является соответствие их возраста той стадии развития, на которой они находились во время извлечения.
В ряде исследований /95/ установлено, что у поздних бластоцист приживляемость была более высокой (41,7%) против 32% у морул и 39% ранних бластоцист. В исследованиях Frim, J. /157/ сохранность поздних бластоцист составила 100%. Ishida T. и др. /182/ отмечают, что более устойчивыми к криоконсервации являются хорошие бластоцисты, 85% которых сохранили свою жизнеспособность и дали 50% стельностей против 38% сохранившихся в хорошем состоянии морул. Мадисон В. и др. /54/ при заморозке ранних бластоцист получили 80,9% сохранности, морул – 77,3%.
Отмечается, что эмбрионы крупного рогатого скота и коз на стадии поздней морулы и ранней бластоцисты более пригодны для криоконсервации, чем экспандированные бластоцисты. После пересадки в первом случае получено 62,5%
