стельностей по отношению к 52,9% во втором. В свою очередь, экспандированные бластоцисты на начальной стадии выхода из зоны пеллюцида также показали более высокий уровень сохранности, нежели экспандированные бластоцисты (23,8% против 21,9%). Эмбрионы крупного рогатого скота можно криоконсервировать и на более ранних стадиях развития так же, как и их половинки, помещенные в зону пеллюцида.
В своих более поздних исследованиях Смыслова Н. и др. /160/ указывают на то, что эмбрионы от поздней морулы до поздней бластоцисты одинаково выдерживают глубокое замораживание и стадия их развития не является критическим фактором для приживляемости эмбрионов.
В свою очередь Сергеев Н. и др. /90/, получивший более высокие показатели по сохранности ранних бластоцист, делает предположение о том, что более низкая выживаемость поздних морул объясняется наличием трех-четырех слоев клеток и плотным межклеточным контактом, что затрудняет проникновение криопротектора и выход воды. Образование бластоцели облегчает протекание обменных процессов и увеличивает криорезистентность эмбрионов на стадии ранней бластоцисты. Однако, с дальнейшим развитием зародыша количество клеток возрастает, межклеточные контакты в эмбриобласте увеличиваются, и транспорт веществ во внутренних слоях замедляется, что требует применения для криоконсервации эмбрионов поздних стадий таких же методов, как для криоконсервации тканевых структур.
Основополагающим фактором, оказывающим самое непосредственное влияние на сохранность и последующую приживляемость замороженно-оттаянных эмбрионов, является криопротектор. Как было сказано выше, криопротекторы можно разделить на две большие группы, проникающие в клетку (ДМСО, глицерин, этиленгликоль) и непроникающие (сахароза и ряд других сахаров).
Сравнительный анализ ДМСО (диметилсульфоксид) и глицерина показал, что при использовании первого у крупного рогатого скота получено 84,6% пригодных к пересадке
зародышей. Криозащитные свойства глицерина оказались менее эффективными. Его использование при криоконсервации увеличивало выход дегенерированных эмбрионов до 39,3%. Эрнст Л., Сергеев Н. /113/ также отмечают тот факт, что для глубокого замораживания эмбрионов наиболее подходящими являются ДМСО и глицерин в концентрации 1,5 М и 1,0-1,4 М, соответственно.
Однако, дальнейшими исследованиями было установлено, что глицерин является менее токсичным по сравнению с ДМСО. В опытах Massip A. /211/ семидневные эмбрионы замораживали в 1,5 М растворе ДМСО и 1,37М глицерине. В первом случае среди замороженных 75,9% зародышей сохранили свою жизнеспособность. Их приживляемость после пересадки составила 35%. Во втором случае эти показатели составили 75% и 52,6%, соответственно.
Что касается концентрации глицерина при насыщении эмбрионов, то наиболее эффективными показали себя 1,4 М растворы глицерина на основании фосфатного буфера. Так, при использовании в качестве криопротектора 1,4 М глицерина приживляемость эмбрионов после пересадки составила 40,6%, а при использовании 1,0М – 27,3% /95/. Аналогичные результаты были получены и в исследованиях других авторов /72/, результаты опытов которых показали, что при использовании как одной, так и другой концентрации сохранность оставалась практически одинаковой 95,9 и 95,6%, приживляемость при использовании в качестве криопротектора 1,4М глицерина составила 40,8%, а при использовании 1,0 М раствора этот показатель находился на уровне 37,1%.
Особый интерес при криоконсервации эмбрионов представляет использование сахарозы, которая значительно ускоряет и упрощает подготовку эмбрионов к пересадке, а производительность труда повышает в 2 раза. При этом сохранность эмбрионов остается на высоком уровне.
Так, исследования некоторых авторов /54, 61/ показали, что использование сахарозы в концентрации 0,7М при удалении криопротектора позволяет сохранить жизнеспособность
80,0...87,5% эмбрионов, а приживляемость таких эмбрионов составляет 55,6%.
Самоделкин А. /85/ считает, что применение сахарозы при подготовке эмбрионов к замораживанию и оттаиванию позволяет получить до 87,7% жизнеспособных эмбрионов и повысить их приживляемость до 55,8%.
Использование сахарозы при криоконсервации позволило Niemann H. /224/ увеличить сохранность эмбрионов на 23,3%.
Исследования ряда последних лет направлены на поиск путей, упрощающих процесс криоконсервации и позволяющих сократить время на данный технологический процесс.
Одним из таких путей является поиск и применение новых криозащитных веществ, которые выгодно бы отличались от ДМСО и глицерина. Наиболее перспективным в данном отношении в настоящее время является этиленгликоль, криозащитные свойства которого, как оказалось, близки к таковым глицерина.
Анализ результатов работы по замораживанию эмбрионов с использованием этиленгликоля показал, что, хотя сохранность эмбрионов и была невысокая (68,7%), приживляемость находилась на уровне 55% /85/.
Высокие криозащитные свойства этиленгликоля были отмечены в работе Lange H. /194/, который проводил свои опыты на интактных и демиэмбрионах. Результативность трансплантации интактных эмбрионов, замороженных в этиленгликоле, составила 58,2% против 48,2% при использовании в качестве криопротектора глицерина. Аналогичные результаты получены и в случае пересадок разделенных эмбрионов – 68,7 и 37,5%, соответственно.
Suzuki Т. et. al. /255/ сообщает о рождении 3 телят, полученных после пересадки замороженно-оттаянных эмбрионов, оплодотворенных и культивированных вне организма. Авторы считают, что значительную роль в этом сыграл примененный в эксперименте криопротектор этиленгликоль в 1,8М концентрации в комплексе с поливинилпирролидоном.
