Эмбрионы свиней по неясным пока причинам невозможно криоконсервировать с удовлетворительным результатом.
Таким образом, из выше сказанного следует вывод о высоких криозащитных свойствах этиленгликоля. В дополнение к этому использование этиленгликоля в качестве криопротектора позволяет проводить так называемые прямые пересадки ("direct transfer"), т.е. проводить пересадки эмбрионов реципиенту сразу после оттаивания без предварительного удаления криопротектора и оценки качества зародыша, что является значительным шагом вперед на пути упрощения технологии трансплантации замороженно-оттаянных эмбрионов и приближает ее по простоте исполнения к искусственному осеменению.
Процесс криоконсервации растянут во времени и продолжается в пределах 2,5...3 часов, что создает определенные трудности и неудобства. Поэтому в последние годы исследования многих ученых направлены на поиск путей, способных сократить затраты времени на криоконсервацию. Наиболее перспективный в этом отношении метод витрификации эмбрионов, сущность которого заключается в насыщении зародышей комплексом криопротекторов в высоких концентрациях с последующим кратковременным охлаждением и погружением в жидкий азот. Криоконсервация в таком случае проводится без программных замораживателей и специальных устройств. Этот способ позволяет сократить продолжительность замораживания до нескольких минут.
По оценкам некоторых исследователей /118, 211, 237/, метод витрификации позволяет получить уже на данном этапе разработки достаточно высокие результаты сохранности и приживляемости зародышей – 70-90 и 57,1%, соответственно.
По некоторым данным /146/, постепенное насыщение зародыша криопротектором до концентрации 40% позволяет получить до 66,7% жизнеспособных эмбрионов и при этом сохранить их приживляемость на уровне эмбрионов, замороженно-оттаянных по традиционному методу. В исследованиях Wilmut J. /274/ выживаемость эмбрионов,
замороженных таким образом, составила 86,8%. Данные результаты подтверждаются работами ряда других исследователей /234, 235/, в опытах которых было установлено, что витрификация позволила сохранить жизнеспособность эмбрионов в 70...87% случаев, а их приживляемость после пересадки составляла от 39,1% до 57,1%. Опыты по совершенствованию витрификационных растворов позволили добиться хороших результатов /146, 213/. В своих работах эти авторы использовали для замораживания и оттаивания эмбрионов 0,5М сахарозу и витрификационный раствор. Приживляемость эмбрионов, замороженных по такой методике, составила 44,8%, а в контроле – 53,5%, в другом случае сохранность эмбрионов удалось увеличить до 85,2%, а приживляемость – до 55,1%.
При криоконсервации важным условием сохранения зародышей является подбор оптимального режима замораживания, который бы позволил проводить обезвоживание клеток с наименьшими потерями для самих эмбрионов.
Медленное замораживание зародышей предусматривает и медленное их оттаивание, что способствует медленному проникновению воды в клетку и исключает повреждение мембран клеток вследствие быстрой регидратации (набухания).
Быстрое замораживание требует и быстрого оттаивания, потому что медленное оттаивание таких эмбрионов может вызвать рекристаллизацию и повреждение клеток /213/. Наиболее оптимальная скорость охлаждения для большинства типов клеток составляет 1 ° С/мин. Однако, оптимальная скорость охлаждения, обеспечивающая оптимальный уровень выживаемости, варьирует как для эмбрионов различных видов животных, так и в зависимости от стадии развития эмбрионов одного и того же вида животного /113/.
Существующие медленный и ускоренный режимы замораживания позволяют получать от 40 до 80% пригодных к пересадке эмбрионов и 30...45% стельностей после пересадки /95, 197, 263/. Согласно исследованиям этих же авторов охлаждение с минус семи до минус двадцати пяти градусов со
скоростью 0,3 ° С/мин. и искусственной кристализации при -7 ° С было получено 55,6% стельностей. Аналогичные результаты получены в опытах Niemann H. et. al. /224/. При одноступенчатом насыщении эмбрионов 1,4 М глицерином и охлаждении со скоростью 0,3 ° -0,1 ° С/мин. до -35 ° С было сохранено 95,3% эмбрионов, а их приживляемость составила 51%. Некоторые исследователи /259/ охлаждали клетки до -4 ° С со скоростью 1 ° С мин. и до -35 ° С со скоростью 40 ° С/мин. После пересадки эмбрионов, замороженных по такой схеме, уровень стельности составил 52%. Охлаждение зародышей до -5 ° С со скоростью 9 ° С/мин. с последующей эквилибрацией в парах жидкого азота до -11,9 ° С и последующим охлаждением до -25 ° С со скоростью 2 ° С/мин. позволило сохранить только 45,6% зародышей, приживляемость которых составила 40% /211/.
Таким образом, соблюдение правильной технологии замораживания позволяет получить до 90% биологически полноценных эмбрионов, а их приживляемость довести до 50...55%. Однако, в производственных условиях эти правила нередко нарушаются, что приводит к снижению результативности метода.
По некоторым данным известно, что использование криоконсервации в производственных условиях рентабельно только в том случае, когда сохранность зародышей находится на уровне не менее 80%, а процент стельности реципиентов составляет 55-60% /193/.
Lehn-Jensen H. /197/ установил достоверное снижение уровня стельности реципиентов в случае, если время от извлечения до криоконсервации превышало три часа. Инкубация эмбрионов более пяти часов снижала уровень стельности на 33% по сравнению с эмбрионами, пересаженными в течение трех часов. К такому выводу пришли и некоторые другие исследователи /224/, которые отмечают, что с увеличением продолжительности хранения эмбрионов от извлечения до замораживания снижалась их жизнеспособность после оттаивания. Так, наивысший процент стельности реципиентов
