разработанные методы стимуляции не позволяют в полной мере использовать потенциальный воспроизводительный фонд, заложенный в яичниках.
При этом индуцирование высокой степени множественной овуляции отрицательно сказывается на выходе полноценных эмбрионов. Высокая вариабельность и непредсказуемость реакции яичников на гонадотропин делает известные методы ненадежными. Одна из основных ролей в решении данного вопроса отводится биотехнологии in vitro, которая в большей мере могла бы удовлетворить потребности как в производстве эмбрионов на определенных стадиях развития, так и в развитии приоритетных направлений в биотехнологии.
Получение полноценных эмбрионов крупного рогатого скота в условиях in vitro зависит от множества факторов, которые обуславливают нормальное ядерное и цитоплазматическое созревание ооцитов, их оплодотворение и развитие эмбрионов до предтрансплантационных стадий. Строгое соблюдение технологических параметров, стандартизация условий культивирования стабилизируют результативность опытов.
Начальным этапом всех работ по технологии in vitro является получение в достаточном количестве исходного материала и его кратковременное или длительное хранение. Как отмечает Гузеватый О.Е. и др. [20] нерегулярность поступления яичников с мясокомбината является сдерживающим фактором по проведению экспериментов по оплодотворению ооцитов коров вне организма. Разработка методов краткосрочного хранения ооцитов позволила бы планомерно проводить опыты, добиваясь наиболее оптимальных сроков культивирования и оплодотворения.
Кратковременное хранение ооцитов можно проводить как в яичниках, так и в синтетических питательных средах. Однако хранение в яичниках до 12-15 часов не отличается высокой эффективностью. До метафазы 2 созревают только около 5-10% клеток из-за закисления фолликулярной жидкости [19]. Поэтому большинство исследователей склоняется к тому, чтобы снизить
до минимума затраты времени от убоя до постановки эксперимента и, что для максимального эффекта это время не должно превышать 1,5-2 часов [35, 98]. Однако для успешного проведения работ важно не только время доставки яичников в лабораторию, но и состав, и температура питательной среды, в которую они помещаются после вазоэктомирования. Так по данным Старостки В.В. [98] наиболее оптимальный режим для транспортировки яичников в лабораторию в течение 1,5-2 часов – +31-+370С. Индекс дробления в этих условиях на 21,7 и 13,7% выше по сравнению с доставкой яичников при температуре 0-6 и 18-230С соответственно. Аналогичные результаты получены в исследованиях Байбекова Ф.Р. [5], который отмечает, что наивысшая степень экспансии кумулюса (84,7%) наблюдалась в опытной группе, яичники которой транспортировались при температуре 370С. В группе, которая доставлялась в лабораторию при 40С экспансия кумулюсных клеток снижалась на 11% (при Р<0,05).
В исследованиях Martino A. et al. [210] вреда для созревания, оплодотворения и получения эмбрионов. Кратковременное воздействие температуры (100 и ниже) также особо отрицательного влияния не оказывает. Однако длительное воздействие таких температур негативно отражается на жизнеспособности клеток.
Как отмечалось выше, при более длительном хранении яичников (10-15 часов) основная часть ооцитов, сохраняемых таким образом, вообще не инициирует мейоз, поэтому в течение такого срока лучше сохранять изолированные ооциты с созданием для них соответствующих условий (5%СО2 в воздухе, максимальная влажность, а также присутствие необходимых энергетических и гормональных добавок).
Значительна вариабельность результатов культивирования и оплодотворения яйцеклеток вне организма в зависимости от индивидуальных особенностей доноров и в первую очередь – от возраста [47]. В отдельных исследованиях по этому вопросу отмечается, что если процент инициации мейоза и оплодотворяемость ооцитов у коров 5-6 лактаций, животных в
возрасте 1,5-2 лет и телочек 1-2 месяцев практически одинаковы, то при дальнейшем культивировании зародышей выявлено, что максимальное число эмбрионов на стадиях морулы и бластоцисты получено из ооцитов молодняка второй и третьей групп. Это подтверждается и исследованиями Журавель Р.И. [27], которая утверждает, что все 100% ооцитов от 1-2-месячных и 48-месячных животных реинициировали мейоз при постановке их на культивирование. Значительно хуже созревали клетки от старых коров (6-8 лет). Наименьший процент ооцитов с дегенерированными клетками обнаружен при культивировании клеток от животных 1-2 месяцев.
В тоже время существует и другое мнение. Gandolfi F. et al [159] исследовали сравнительную способность к созреванию in vitro ооцитов, полученных от неполовозрелых телят (10-14 недель) и от зрелых коров. Отмечается, что ооциты телят характеризуются меньшим диаметром по сравнению с ооцитами коров, низкой скоростью метаболизма пирувата и глутамина и пониженной белоксинтезирующей активностью, что рассматривается как факторы, снижающие способность ооцитов к созреванию in vitro.
Функциональное состояние яичников также имеет немаловажное значение при получении эмбрионов вне организма. Как известно, яичники претерпевают морфологические и физиологические изменения в течение всего полового цикла. Наименьший процент клеток с дегенерированными хромосомами был обнаружен, когда культивировали ооциты с плотным кумулюсом из яичников в стадии фолликулярного роста и наибольший при культивировании яичников с признаками овуляции. При этом разница была достоверна (Р<0.05) [27187, 209]. Немаловажным фактором, влияющим на эффективность получения эмбрионов in vitro, является фаза полового цикла, в которую отбирали яичники. Boedino A. et al [130] были проведены опыты с целью изучения эффективности использования яичников коров в лютеальную фазу. В первом опыте отбирали яичники в лютеальной фазе с активным желтым
