телом и яичники в фолликулярной фазе. Количество ооцитов, выделенных из яичников, и уровень дробления эмбрионов практически не отличались 12 и 10; 84 и 89% в лютеальную и фолликулярную фазы соответственно, но выход бластоцист был значительно выше (Р<0,05) в 1-й группе против 2-ой. Во втором опыте отбирали яичники с желтым телом и без него. Среднее количество ооцитов на яичник с желтым телом и без него не отличались (15 и 15). Уровень дробления эмбрионов был выше (Р<0,01) в группе без желтого тела, по сравнению с группой с желтым телом (88 и 75% соответственно). Однако выход бластоцист в группе яичников с желтым телом был выше (Р<0,01) по сравнению с группой без желтого тела – 24 против 13%. Таким образом, приведенные данные показывают, что высокие результаты можно получить не только при использовании яичников в фолликулярной, но и в лютеальной фазе.
Лобченко В.А. [52] считает, что наиболее подходящим источником ооцитов в количественном и качественном отношении могут быть яичники животных в диэструсе или проэструсе, а яичники в метэструсе практически не пригодны для получения полноценных ооцитов, способных к дальнейшему развитию.
Наличие и размер фолликулов также оказывает влияние на полноценное развитие клеток [186]. Так, наиболее высокие результаты получены при культивировании ооцитов, полученных из яичников, в которых имелся один фолликул диаметром более 10 мм или более 10 фолликулов диаметром от 2 до 5 мм по сравнению с яичниками, у которых фолликул диаметром более 10 мм отсутствовал вообще или фолликулов диаметром от 2 до 5 мм было менее 10. Аналогичные результаты получены и в исследованиях других авторов [120, 234, 181].
Hаwk H. et al [170] так же считают, что размер фолликулов влияет на созревание ооцитов. В процессе проведенных ими опытов фолликулы разделялись на три группы: плохие, средние, хорошие, а ооциты на хорошие и плохие. Исследовали фолликулы диаметром менее 3мм, от 3 до 8 мм. При анализе
уровня созревания, ооциты плохого качества показали самые низкие результаты, независимо от качества и диаметра фолликулов. Наиболее высокие результаты были получены при культивировании клеток из средних по качеству фолликулов диаметром 3-8 мм.
Stoсk A. и Smith K. [433] проведены аналогичные исследования, указывающие на влияние размера фолликула и кумулюса на созревание ооцитов. В эксперименте использовались ооциты из малых фолликулов диаметром менее 6 мм. Эти ооциты культивировались совместно с кумулюсом ооцитов из больших и малых фолликулов или с ооцитами без кумулюса из аналогичных по размеру фолликулов. По уровню дробления разницы между группами не установлено. Однако выход эмбрионов на стадии морула - бластоциста резко сокращался в среде с добавлением кумулюса ооцитов из больших фолликулов, что показывает на негативное влияние кумулюса ооцитов из больших фолликулов на развитие ооцитов из малых фолликулов.
Однако, некоторые из них считают, что созревание ооцитов не зависит от клеточного окружения, целостности ооплазмы и стадии хроматина. По мнению этих исследователей, существует тесная связь между типом кумулюса окружающего ооцит и созреванием ооцита [207].
Популяция ооцит – кумулюсных комплексов из антральных фолликулов гетерогенна в связи с тем, что в яичнике одновременно идут процессы роста и развития одних фолликулов и ооцитов и атрезия зрелых, что проявляется не только морфологически, но и в способности ооцитов созревать вне организма до стадии оплодотворения.
Критериев, которые позволили бы быстро отличить третический ооцит от растущего не разработаны, поэтому наиболее распространенным способом определения жизнеспособности ооцитов в настоящее время является их оценка по морфологическим показателям: состоянию кумулюса, его взаимосвязи с ооцитом, состоянию зоны и ооплазмы.
Первым признаком, говорящим о биологической
полноценности клетки, является наличие плотного многослойного кумулюса, плотно связанного с равномерной по толщине без видимых, изъянов апполесцирующей блестящей оболочкой, а также без видимых признаков гранулярной конденсации, мелкозернистой ооплазмой, равномерно заполняющей перивителлиновое пространство. Наличие каких либо отклонений говорит о снижении качества ооцита или его гибели.
Анализ результатов исследований Гузеватого О.Е. и др. [71] говорит о положительном влиянии предварительного отбора ооцитов. При этом уровень клеток, реаинициировавших мейоз и завершивших мейотическое созревание, был на 28,4 и 20,7% выше по сравнению с неотселекционированными.
Аналогичные показатели получены в исследованиях Байбекова Ф. [5]. Наивысшую степень реиниации мейоза, по кумулюсной экспансии (84,7%) показали ооциты, оцененные как хорошие. В группах средних и плохих уровень профилирации кумулюсных клеток составил 62,1 и 24,5% соответственно.
Разработанные в настоящее время методы культивирования ооцитов позволяют получать до 90% клеток на стадии «метафаза II». Однако при последующем оплодотворении и культивировании до предимплантационных стадий развивается не многим более 30%. Причиной этому служат многие факторы. В первую очередь необходимо понимать, что созревание ооцитов это комплексный процесс, включающий в себя мейотическое преобразование ядра, цитоплазматическое созревание и преобразование мембраны. Поэтому если для завершения ядерного созревания in vitro ооцитам достаточно обеспечить в средах энергетический и гормональный минимум, то цитоплазматическое созревание обеспечивается целым рядом биологически активных веществ, обеспечивающих в дальнейшем успешное оплодотворение яйцеклетки и развитие ранних зародышей до предимплантационных стадий.
Для полноценного созревания ооцитов в культуре in vitro необходимо создать условия, максимально соответствующие
