естественным, т.е. тем, в которых обеспечиваются нормальное функционирование механизмов регуляции оогенеза in vivo. По мнению Кауффольда П. и др. [32] для создания таких условий требуется присутствие сыворотки крови, содержащей компоненты, способствующие выживанию и развитию клеток, среди которых особое значение имеют полипептидные факторы роста (ППФР), а именно: инсулиноподобный фактор (ИФР) и факторы роста эпидермиса (ФРЭ), тромбоцитов (ФРТ) и фибробластов (ФРФ). В настоящее время получены данные о действии ППФР только на процессы мейотического деления клеток.
Кривохарченко А. [43] установил, что сложные, содержащие аминокислоты, витамины и другие вещества среды могут применяться для культивирования ооцитов мышей без каких-либо белковых добавок. При этом процент эмбрионов, развивающихся до стадии вылупившейся бластоцисты, не снижается. Более высокие показатели выхода бластоцист были в том случае, когда использовались инактивированные сыворотки – 23,1% против 6,7% без инактивации [35].
В исследованиях Mingoti G. [216] оценивалась эффективность нескольких сывороток: фетальной крупного рогатого скота, коров в стадии проэструса, эструса или метаэструса. По результатам испытаний выявлено, что в целом добавление сывороток в питательную среду повышало синтез прогестерона и эстрадиола. Более высокий уровень дробления клеток достигнут при использовании эстральной сыворотки. Кроме этого установлено, что сыворотка стабилизирует рН, оказывает антипролеотическое действие и способствует более быстрой адаптации культивируемых объектов к условиям культуральных сред.
Игнатенко Л.В. и др. [31,191] провели опыт по изучению влияния фетальной сыворотки на созревание ооцитов. Применяли следующие системы созревания клеток: 1. Среда Паркера (МРМ) 20% фетальной сыворотки 40 мкг/мл гепарина. 2. Монослой клеток кумулюса сформированных за 144 часа в среде МРМ 15% фетальной сыворотки 40 мкг/мл гентамицина.
Кондиционная среда, собранная с монослоя через 144 часа. В среде Паркера через 24 часа до стадии телофаза I – метафаза II созревало 80% ооцитов. Остальные 20% ооцитов имели признаки дегенерации.
Однако существует и другое мнение по поводу необходимости использования белковых добавок при получении эмбрионов вне организма. Так, Ymaschita T. et.al [276], Azato M. [120] утверждают, что бессывороточные среды показали большую эффективность при получении биологически полноценных эмбрионов по сравнению со средами с добавлением фетальной сыворотки.
Такого же взгляда придерживается Tornesi M. [262], в исследованиях которого различий между сывороточными и безсывороточными средами не обнаружено, хотя он и отмечает, что этот вопрос требует дальнейшего изучения.
Помимо сыворотки крови нормальному созреванию ооцитов, как считает, Гузеватый О.Е. [20] способствует введение в культуральную среду свежих или инкубированных гранулезных, а также кумулюсных клеток, что позитивно влияет не только на дозревание фолликулярных ооцитов до стадии метафаза II, но значительно увеличивает индекс дальнейшего дробления эмбрионов.
Fukui Y. et. al. [158] в своих исследованиях также показали необходимость присутствия в культуре in vitro клеток гранулёзы. Ооциты извлекали из фолликулов размером 1 – 5 мм и культивировали с клетками гранулёзы и без них. Клетки гранулёзы извлекали из фолликулов суперовулировавших коров – доноров в день охоты. Процент ооцитов, завершивших созревание с клетками гранулёзы и без них, практически не различался (70 и 73%), так же как процент оплодотворенных ооцитов и процент ооцитов с мужским пронуклеусом (94 и 91%). Однако дальнейшего развития эмбрионов из ооцитов, созревших без клеток гранулёзы, не отмечено (0/44), а эмбрионы из ооцитов, созревшие с клетками гранулёзы, развивались до морул и бластоцист в 36% случаев.
По результатам других исследований [105] установлено,
что в целом введение в культуральную систему клеток гранулёзы приводит к торможению созревания ядер. Так, до стадии телофазы и метафазы II созрело 60,8% против 35,5% при использовании свежих и 37,1% при использовании проинкубированных гранулёзных клеток. Однако, в то же время установлено, что применение проинкубированных гранулёзных клеток во время созревания привело к повышению процента оплодотворения и дробления по сравнению со свежими 49,4; 21,0% и 29,6; 9,1% соответственно.
Не менее важной составляющей синтетических питательных сред являются гормоны, активизирующие процессы созревания ооцитов в культуре in vitro. При этом по данным Сироткина А. и др. [92], действие вводимых гормонов носило различный характер. Так, ЛГ, СЖК и вазоцин стимулируют реиниацию и прохождение созревания; люлибирин, вазопрессин, окситоцин и малые дозы ФСГ на эти процессы не влияли, а пролактин и большие дозы ФСГ тормозили мейоз на стадиях диплотены метафазы 1. Авторы предполагают, что на ранних стадиях фолликулогенеза ФСГ стимулирует пролиферацию фолликулярных клеток и продукцию ими ингибиторов созревания ооцитов, а по мере созревания фолликул приобретает чувствительность к ЛГ, который блокирует секрецию и действие этого ингибитора, а также стимулирует ядерное созревание яйцеклеток. В пользу этого предположения свидетельствует факт стимуляции созревания сывороткой жеребых кобыл (СЖК), обладающей ФСГ и ЛГ активностью. В работе Arlotto T. [119] установлено, что при добавление в среду эстральной сыворотки эффект ФСГ/ЛГ активности теряется, но влияет на количество клеток в эмбрионе. Так, если при добавлении ФСГ/ЛГ в среду, где имеется сыворотка число клеток в расчёте на бластоцисту составило 117, то без ФСГ/ЛГ их количество возрастало до 125.
Brackett B. et.al. [135], анализируя влияние гормонов на эффективность созревания ооцитов, отмечают, что добавление в раствор бычьего гормона роста активизирует ядерное созревание по сравнению с ФСГ, эффективность которого значительно
