полноценности клетки, является наличие плотного многослойного кумулюса, плотно связанного с равномерной по толщине без видимых, изъянов апполесцирующей блестящей оболочкой, а также без видимых признаков гранулярной конденсации, мелкозернистой ооплазмой, равномерно заполняющей перивителлиновое пространство. Наличие каких либо отклонений говорит о снижении качества ооцита или его гибели.
Анализ результатов исследований Гузеватого О.Е. и др. [71] говорит о положительном влиянии предварительного отбора ооцитов. При этом уровень клеток, реаинициировавших мейоз и завершивших мейотическое созревание, был на 28,4 и 20,7% выше по сравнению с неотселекционированными.
Аналогичные показатели получены в исследованиях Байбекова Ф. [5]. Наивысшую степень реиниации мейоза, по кумулюсной экспансии (84,7%) показали ооциты, оцененные как хорошие. В группах средних и плохих уровень профилирации кумулюсных клеток составил 62,1 и 24,5% соответственно.
Разработанные в настоящее время методы культивирования ооцитов позволяют получать до 90% клеток на стадии «метафаза II». Однако при последующем оплодотворении и культивировании до предимплантационных стадий развивается не многим более 30%. Причиной этому служат многие факторы. В первую очередь необходимо понимать, что созревание ооцитов это комплексный процесс, включающий в себя мейотическое преобразование ядра, цитоплазматическое созревание и преобразование мембраны. Поэтому если для завершения ядерного созревания in vitro ооцитам достаточно обеспечить в средах энергетический и гормональный минимум, то цитоплазматическое созревание обеспечивается целым рядом биологически активных веществ, обеспечивающих в дальнейшем успешное оплодотворение яйцеклетки и развитие ранних зародышей до предимплантационных стадий.
Для полноценного созревания ооцитов в культуре in vitro необходимо создать условия, максимально соответствующие
естественным, т.е. тем, в которых обеспечиваются нормальное функционирование механизмов регуляции оогенеза in vivo. По мнению Кауффольда П. и др. [32] для создания таких условий требуется присутствие сыворотки крови, содержащей компоненты, способствующие выживанию и развитию клеток, среди которых особое значение имеют полипептидные факторы роста (ППФР), а именно: инсулиноподобный фактор (ИФР) и факторы роста эпидермиса (ФРЭ), тромбоцитов (ФРТ) и фибробластов (ФРФ). В настоящее время получены данные о действии ППФР только на процессы мейотического деления клеток.
Кривохарченко А. [43] установил, что сложные, содержащие аминокислоты, витамины и другие вещества среды могут применяться для культивирования ооцитов мышей без каких-либо белковых добавок. При этом процент эмбрионов, развивающихся до стадии вылупившейся бластоцисты, не снижается. Более высокие показатели выхода бластоцист были в том случае, когда использовались инактивированные сыворотки – 23,1% против 6,7% без инактивации [35].
В исследованиях Mingoti G. [216] оценивалась эффективность нескольких сывороток: фетальной крупного рогатого скота, коров в стадии проэструса, эструса или метаэструса. По результатам испытаний выявлено, что в целом добавление сывороток в питательную среду повышало синтез прогестерона и эстрадиола. Более высокий уровень дробления клеток достигнут при использовании эстральной сыворотки. Кроме этого установлено, что сыворотка стабилизирует рН, оказывает антипролеотическое действие и способствует более быстрой адаптации культивируемых объектов к условиям культуральных сред.
Игнатенко Л.В. и др. [31,191] провели опыт по изучению влияния фетальной сыворотки на созревание ооцитов. Применяли следующие системы созревания клеток: 1. Среда Паркера (МРМ) 20% фетальной сыворотки 40 мкг/мл гепарина. 2. Монослой клеток кумулюса сформированных за 144 часа в среде МРМ 15% фетальной сыворотки 40 мкг/мл гентамицина.
Кондиционная среда, собранная с монослоя через 144 часа. В среде Паркера через 24 часа до стадии телофаза I – метафаза II созревало 80% ооцитов. Остальные 20% ооцитов имели признаки дегенерации.
Однако существует и другое мнение по поводу необходимости использования белковых добавок при получении эмбрионов вне организма. Так, Ymaschita T. et.al [276], Azato M. [120] утверждают, что бессывороточные среды показали большую эффективность при получении биологически полноценных эмбрионов по сравнению со средами с добавлением фетальной сыворотки.
Такого же взгляда придерживается Tornesi M. [262], в исследованиях которого различий между сывороточными и безсывороточными средами не обнаружено, хотя он и отмечает, что этот вопрос требует дальнейшего изучения.
Помимо сыворотки крови нормальному созреванию ооцитов, как считает, Гузеватый О.Е. [20] способствует введение в культуральную среду свежих или инкубированных гранулезных, а также кумулюсных клеток, что позитивно влияет не только на дозревание фолликулярных ооцитов до стадии метафаза II, но значительно увеличивает индекс дальнейшего дробления эмбрионов.
Fukui Y. et. al. [158] в своих исследованиях также показали необходимость присутствия в культуре in vitro клеток гранулёзы. Ооциты извлекали из фолликулов размером 1 – 5 мм и культивировали с клетками гранулёзы и без них. Клетки гранулёзы извлекали из фолликулов суперовулировавших коров – доноров в день охоты. Процент ооцитов, завершивших созревание с клетками гранулёзы и без них, практически не различался (70 и 73%), так же как процент оплодотворенных ооцитов и процент ооцитов с мужским пронуклеусом (94 и 91%). Однако дальнейшего развития эмбрионов из ооцитов, созревших без клеток гранулёзы, не отмечено (0/44), а эмбрионы из ооцитов, созревшие с клетками гранулёзы, развивались до морул и бластоцист в 36% случаев.
По результатам других исследований [105] установлено,
