животных с известным генетическим потенциалом на любой стадии полового цикла без стимуляции множественного роста фолликулов с достаточно высокой повторяемостью сеансов аспирации без какого – либо ущерба здоровью животного. Однако в настоящий момент эффективность метода значительно варьирует и зависит от многих факторов [136,141].
Для успешного проведения работ по получению эмбрионов вне организма необходимо соблюсти два непременных условия: ооциты должны достичь стадии оплодотворения, а сперматозоиды пройти процесс капацитации. В естественных условиях сперматозоиды проходят подготовку к оплодотворению в половых путях самки. Вне организма капацитацию сперматозоидов проводят искусственно в питательных синтетических средах. Природа капацитации до конца не ясна [264], а время, требуемое для нее у разных видов животных не одинаково. Капацитация включает в себя удаление семенной плазмы с поверхности спермы, которая может маскировать рецептор, необходимый для взаимодействия «спермий - яйцеклетка». Маточная фаза капацитации изменяет плазменную и внешнюю акросомальную мембраны. Через деструктуированную мембрану вымываются протеолетические ферменты, необходимые для пенетрации сперматозоидом зоны пеллюцида.
Капацитация и последующая акросомная реакция необходимы для успешного оплодотворения ооцитов. После выдержки спермы в гипертонической среде происходит изменение характера движения спермиев, которое отражает нарастающую метаболическую активность, имеющую отношение к кислородному обмену в сперме при капацитации in vitro [128, 154, 166, 292].
По мнению многих авторов капацитацию сперматозоидов рекомендуется проводить при температуре +390С. Считается, что только при такой температуре индуцируется акросомная реакция. Однако опыты Uchockiene D. et. аl. [264] показали, что оплодотворение ооцитов спермой, инкубированной при +380С и +38,50С по сравнению с капацитацией при 390С повышало их
оплодотворяемость на 4,4 и 18,8% соответственно. Среди веществ, способных вызвать в условиях in vitro капацитацию и акросомную реакцию важную роль играют двухвалентные и одновалентные катионы Са2+, Mg2+, Na+, K+. Особый интерес вызывает применение растворов высокой ионной силы (КребсаРиггера, Тироде) и гепарина. Использование этих веществ при подготовке сперматозоидов быка способствовало получению потомства после оплодотворения. Так, добавление в сперму при капацитации гепарина повышает уровень дробления зародышей с 38,5% до 43,8% [135], что подтверждается и другими исследователями [56]. По их утверждению увеличение концентрации гепарина с 2 до 10 мкг/мл увеличивает пенетрацию ооцитов с 46,6% до 68,3%. В средах с высокой ионной силой и в присутствии гепарина наблюдалось набухание акросомы и везикуляция мембраны, характерные для капацитации. Наилучшие результаты были получены при использовании ионов кальция в стимулированных гепарином сперматозоидах быка [142] Авторы отмечают, что присутствие гепарина в среде для капацитации увеличивает концентрацию цитоплазматического Са2+ на 60%. Это увеличение происходит за счет поступления ионов кальция из вне через кальциевые мембранные каналы.
Важную роль в индукции капацитации и акросомной реакции играют отмывание сперматозоидов от семенной плазмы. Показано, что сперматозоиды кролика, быка и человека, отмытые от семенной плазмы самопроизвольно связывают экзогенную ДНК. Выделено три фазы взаимодействия ДНК со сперматозоидами: адсорбция, проникновение и элиминация [153].
Процесс капацитации сперматозоидов неразрывно связан с оплодотворением. Для оплодотворения созревших in vitro ооцитов, т.е. достигших стадий созревания метафазы II, в большинстве лабораторий используют следующие среды: Тироде, ХЭМ-Ф10 с добавлением эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, пенициллина, стрептомицина, гентомицина и других компонентов [30].
Маленко Г.П. [56] предлагает созревшие in vitro ооциты и сперматозоиды инкубировать в среде Тироде с 6 мг/мл альбумина, 10 мкг/мл гепарина и 40 мкг/мл гентамицина. При таких условиях оплодотворяемость ооцитов составила 67,2%. Качанская В.В., Кузьмина Т.И. [33] предлагают добавление в среду для оплодотворения (среда Бринстера) гиалуронидазы в концентрации 10мкг/мл. При этом процент выхода эмбрионов увеличивается с 14 до 22,6% при достоверной разницы.
Экстракорпоральное оплодотворение ооцитов включает ряд процессов, обеспечивающих слияние гамет: контакт и пенетрацию окружающих ооцит сперматозоидами, проникновение через зону пеллюцида, слияние мембран ооцита и сперматозоида, слияние пронуклеусов.
В первых опытах по оплодотворению оплодотворяемость не превышала 20%. В 1982 году впервые был получен теленок после оплодотворения тубального ооцита [11]. При этом процесс оплодотворения происходил в среде Тироде Б. По данным большинства авторов оплодотворяемость тубальных ооцитов колеблется от 48 до 70% при дроблении яйцеклеток на уровне 10-40%. В настоящее время к оплодотворению тубальных ооцитов прибегают редко. Вся работа по получению эмбрионов in vitro проводится с изолированными клетками, т.е. с ооцитами, выделенными из фолликулов.
В 1983 году родился первый в СССР теленок после оплодотворения созревшего in vitro фолликулярного ооцита. Каждому реципиенту пересаживали по несколько 2-4 клеточных эмбрионов. В результате такой трансплантации и родился живой теленок. Однако трансплантация зародышей на такой стадии требует хирургического вмешательства, поскольку эмбрионы в таком возрасте необходимо трансплантировать в яйцевод, что существенно усложняет процедуру пересадки. Поэтому основным направлением исследований в последнее время является получение эмбрионов на предтрансплантационных стадиях, пригодных для трансплантации нехирургическим путем.
