Начальным этапом таких работ в бывшем СССР явилось использование промежуточных хозяев и в частности яйцеводы крольчих, т.е. после экстракорпорального оплодотворения зиготы помещались в лигатированные яйцеводы ложно беременной крольчихи, где они и развивались до стадии морулы-бластоцисты. После извлечения и оценки жизнеспособности их трансплантировали синхронным по циклу реципиентам. Другим вариантом такой работы было осеменение созревших in vitro ооцитов в половых путях крольчихи. Следует отметить, что в этом случае количество биологически полноценных, пригодных к трансплантации эмбрионов было в 2- 3 раза больше. Помимо этого было установлено, что приживляемость эмбрионов, полученных после оплодотворения в яйцеводе крольчихи, составила 27,3%, а от экстракорпорального – лишь 4,8% [30].
Однако, несмотря на положительные результаты, достигнутые в работах по оплодотворению ооцитов вне организма, сам метод оставался громоздким и не отличался достаточной эффективностью, в связи с чем исследования по его совершенствованию продолжаются до настоящего времени. Достигнутый за это время прогресс в изучении воспроизводительной функции, физиологии оогенеза и раннего эмбриогенеза крупного рогатого скота, разработке и производстве высокоэффективного оборудования, препаратов и питательных сред позволил поднять технологию in vitro на качественно новый уровень, Как известно, развитие половых клеток млекопитающих как in vivo так и in vitro всецело зависят от внутренних условий метаболизма и внутриклеточной регуляции, что в свою очередь обеспечивается полноценностью окружающей клетку питательной среды и эффективностью транспортировки через мембрану клетки необходимых компонентов, участвующих в процессах роста, развития и дифференцировки клеток.
Как показали исследования Campbell K. et. al [138], одна из основных ролей в транспорте извне и во внутрь клетки принадлежит интегринам.
Интегрины – это семейство трансмембранных рецепторов, регулирующих внутри и внеклеточные механизмы восприятия (опознания) молекул и молекулярных соединений.
Интегрины находятся на поверхности гамет и принимают непосредственное участие в инициации взаимодействия между сперматозоидом и ооцитом во время оплодотворения.
В связи с чем, исследования последних лет направлены на создание условий для созревания, капацитации, оплодотворения и культивирования ранних зародышей, максимально приближенных к естественным условиям репродуктивного тракта самки и выявление основных факторов, оказывающих решающее воздействие на полноценное созревание, оплодотворение и развитие эмбрионов до стадии морулыбластоцисты.
Результаты, достигнутые разными группами исследователей с использованием различных систем культивирования, не поддаются анализу. Их эффективность, начиная от технологических элементов, используемых авторами, их квалификации, лабораторного обеспечения, питательных и газовых сред в каждой лаборатории варьирует в значительной степени, что в свою очередь ведет к значительной вариабельности результатов исследования [16].
Как было установлено, максимально снизить вариабельность выхода эмбрионов на стадии бластоцисты можно путем использования проверенных базовых сред и дополнительным добавлением к ним активизирующих процесс капацитации и оплодотворения химических компонентов (гепарин, кофеин, гипотаурин, ионофор и т.д.).
Другими элементами, влияющими на достижение положительного результата, являются: объем питательной среды, количество ооцитов на единицу площади, концентрация спермы и многие другие [135]. Так, например, Boguest W. et. al. [131] отмечает, что при присутствии в среде для оплодотворения глутатиола отмечается тенденция увеличения выхода зигот со вторым пронуклеусом. Кроме того, глутатиол характеризуется оксидантными свойствами, предохраняя мембрану от жирового
переокисления. Положительное влияние глутатиола на формирование пронуклеуса отмечает и Soom A. et. al. [247]. Добавление глутатиола в среду для оплодотворения удваивало количество бластоцист (42% против 23%), а также уровень вышедших из зоны (20% и 9% соответственно). Как отмечает Taneja M. [259] эффективность глутатиола еще более возрастает в присутствии кофеина и гепарина. Выход бластоцист увеличивается по сравнению с контролем на 9,3% и 29,4% соответственно [259].
О важности присутствия кофеина в среде для оплодотворения говорит и опыт Brackett B. et al.[135], которые отмечают, что присутствие последнего значительно увеличивало уровень оплодотворяемости ооцитов. С этим соглашается и Abeydeera L. et. al. [116] в опытах которого присутствие кофеина увеличивало уровень пенетрации независимо от его концентрации.
Исследованиями Brackett B. et al. [135] установлено, если концентрация спермы от 1 до 8 млн. на 1 мл не влияла на уровень дробления, то концентрация 1 и 2х106 улучшала выход морул и бластоцист.
На процесс и эффективность оплодотворения вне организма огромное влияние оказывает качество и состав питательной среды, в которой происходит совместная инкубация ооцитов и спермиев. Наряду с качеством и составом сред для оплодотворения важное значение имеет время совместного инкубирования ооцитов со сперматозоидами. По мнению одних авторов ооциты со спермиями должны инкубироваться совместно 12-16 часов [62], других – 18 часов [140]. Согласно третьим существенной разницы между продолжительностью совместного культивирования в течение 5 часов и в течение 20 часов не обнаружено [160, 254].
Однако, несмотря на очевидный прогресс в повышении эффективности оплодотворения ооцитов вне организма, выход бластоцист, пригодных к пересадке, по-прежнему остается невысоким. Одним из факторов, влияющим на развитие
