эмбрионов in vitro, является так называемый окислительный стресс, причиной которого является постоянно увеличивающееся количество продуктов окисления в процессе метаболизма в клетке. Одним из антиоксидантов, предохраняющим гаметы и эмбрионы от разрушительного воздействия окисления является гипотаурин, присутствующий в жидкости яйцеводов.
По результатам исследования Guader C. et al [152] установлено, что наиболее высокую эффективность гипотаурин оказывает в концентрации 0,5;1 и 2 мМ. Выход бластоцист в этом случае составил 40,9; 41,1 и 35,1% соответственно. Немаловажную роль в поддержании соответствующего рН среды играет и газовый состав атмосферы, окружающей эмбрионы при их культивировании in vitro.
Оплодотворенные яйцеклетки, культивируемые при 10% концентрации О2 в воздухе, хотя и дробились, но развивались достаточно медленно, что говорит об ингибирующем воздействии на профилиративные процессы в клетках высоких концентраций кислорода [221].
Анализ результатов воздействия различных концентраций кислорода на эффективность получения бластоцист in vitro в исследованиях Caamano J. [153] подтвердил вывод, сделанный выше. Если при концентрации О2 20% выход бластоцист составил 13,7%, то её снижение до 5% увеличило их выход практически в 2 раза (25,1%).
Nagao Y. [221] отмечает в свою очередь, что уровень концентрации кислорода зависит от количества эмбрионов в капле питательной среды. В его исследованиях установлено, что наиболее высокий выход бластоцист отмечен в том случае, когда при культивировании одного эмбриона уровень кислорода составлял 1%; 2-х – 2,5%; а 25 эмбрионов – 5%.
Уровень концентрации СО2 может зависеть от питательной среды. Так, по утверждению Farin C. et al. [156] использование среды Менезо требует меньшей концентрации СО2 по сравнению с ТС-199 (3% против 5% соответственно).
Много внимания при получении эмбрионов in vitro
уделяется вопросу энергетического обеспечения их роста и развития. Pinyopummiter T. et al. [233] отмечают, что только единичные зародыши достигли стадии дробления без экзогенных источников энергии, а глютамин как в отдельности, так и в сочетании с глюкозой не поддерживает раннее развитие эмбрионов. Лактат и пируват каждый в отдельности являются хорошими источниками энергии. Аминокислоты не поддерживают процесс дробления, однако в комбинации с лактатом кальция значительно увеличивают развитие бластоцист [231], с пируватом натрия такого не наблюдается. О том, что добавление в питательную среду витамина E ускоряло формирование экспандированных и вышедших из зоны пеллюцида бластоцист, отмечают и Olson S. et al. [229]. Ускоряет процесс появления 9-16 клеточных эмбрионов и формирование морул-бластоцист также добавление фетальной или эстральной сыворотки крупного рогатого скота [259, 155, 170, 195].
Выбор компонентов среды представляет особый интерес в плане стандартизации условий культивирования. Важная роль в этом отношении отводится фолликулостимулирующему гормону (ФСГ), который принимает самое непосредственное участие в инициации мейоза и развитии ранних зародышей даже в небольших количествах [122]. Так, снижение его концентрации с 0,05 И.Е./мл до 0,01 И.Е./мл не оказало отрицательного влияния на развитие оплодотворенных ооцитов до бластоцисты и количество в ней клеток. Baranao J. [122] добавлял ФСГ в дозах от 0 до 2000 мг/мл. По результатам исследования было установлено, что если выход морул увеличивался по мере увеличения концентрации гормона с 21,6% в контроле до 38,5% при концентрации 2000мг/мл, то выход бластоцист был наиболее высоким при уровне ФСГ 200 мг/мл. Далее их выход снижался.
Хорошим гормональным и энергетическим субстратом при культивировании эмбрионов in vitro является монослой из клеток репродуктивного тракта самок, а также клеток кумулюса, которые способствуют преодолению блока дробления на 8-16
клеточной стадии и благоприятствуют развитию зародышей до стадии морулы-бластоцисты [155, 204]. Еще одной группой биологически активных веществ, влияющих на эффективность получения эмбрионов in vitro, являются ростовые факторы, к которым относятся инсулиноподобный фактор роста, фибринальный фактор роста, эпидермальный фактор роста и ряд других. По данным Lee E. et al. [196] добавление ростовых факторов не влияло на выход дробящихся зародышей до 2-8 клеточной стадии, однако увеличивало, и значительно (Р<0,05) выход морул-бластоцист. Наиболее эффективным фибринальный фактор роста оказался в концентрации 0,05мг/мл. О позитивном влиянии вышеперечисленных факторов на развитие и биологическую полноценность эмбрионов говорится и в работе Gandolfi F. еt. al. [160].
Много внимания уделяется и вопросу плотности ооцитов на объем среды. Так, выход бластоцист на 10 день был ниже в малых группах ооцитов (1-6 в капле) нежели в больших. Однако не было различий, от величины групп на выход эмбрионов, когда ооциты культивировались на монослое клеток печени буйвола. Тем не менее, когда эмбрионы культивировались по отдельности, количество клеток (клеточная масса) у них было меньше, чем при культивировании в группах.
Бластоцисты появлялись значительно раньше в случае когда они инкубировались с клетками печени буйвола, при этом и количество клеток в эмбрионе у них была выше [151].
Аналогичного мнения придерживается и O′Doherty E. [228], который также утверждает, что ооциты, созревающие в группах, показали значительно лучший результат по сравнению с «одиночками», По уровню клеток, достигших метафазы II, эта разница составила 18,8%, а по выходу бластоцист – 7%. Кроме того, было установлено, что концентрация сперматозоидов ниже 2000 снижает уровень дробления и выход бластоцист. Оптимальное соотношение 2000 сперматозоидов в 20 мл среды для оплодотворения.
Таким образом, несмотря на достигнутые успехи в области экстракорпорального оплодотворения ооцитов крупного
