оплодотворяемость на 4,4 и 18,8% соответственно. Среди веществ, способных вызвать в условиях in vitro капацитацию и акросомную реакцию важную роль играют двухвалентные и одновалентные катионы Са2+, Mg2+, Na+, K+. Особый интерес вызывает применение растворов высокой ионной силы (КребсаРиггера, Тироде) и гепарина. Использование этих веществ при подготовке сперматозоидов быка способствовало получению потомства после оплодотворения. Так, добавление в сперму при капацитации гепарина повышает уровень дробления зародышей с 38,5% до 43,8% [135], что подтверждается и другими исследователями [56]. По их утверждению увеличение концентрации гепарина с 2 до 10 мкг/мл увеличивает пенетрацию ооцитов с 46,6% до 68,3%. В средах с высокой ионной силой и в присутствии гепарина наблюдалось набухание акросомы и везикуляция мембраны, характерные для капацитации. Наилучшие результаты были получены при использовании ионов кальция в стимулированных гепарином сперматозоидах быка [142] Авторы отмечают, что присутствие гепарина в среде для капацитации увеличивает концентрацию цитоплазматического Са2+ на 60%. Это увеличение происходит за счет поступления ионов кальция из вне через кальциевые мембранные каналы.
Важную роль в индукции капацитации и акросомной реакции играют отмывание сперматозоидов от семенной плазмы. Показано, что сперматозоиды кролика, быка и человека, отмытые от семенной плазмы самопроизвольно связывают экзогенную ДНК. Выделено три фазы взаимодействия ДНК со сперматозоидами: адсорбция, проникновение и элиминация [153].
Процесс капацитации сперматозоидов неразрывно связан с оплодотворением. Для оплодотворения созревших in vitro ооцитов, т.е. достигших стадий созревания метафазы II, в большинстве лабораторий используют следующие среды: Тироде, ХЭМ-Ф10 с добавлением эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, пенициллина, стрептомицина, гентомицина и других компонентов [30].
Маленко Г.П. [56] предлагает созревшие in vitro ооциты и сперматозоиды инкубировать в среде Тироде с 6 мг/мл альбумина, 10 мкг/мл гепарина и 40 мкг/мл гентамицина. При таких условиях оплодотворяемость ооцитов составила 67,2%. Качанская В.В., Кузьмина Т.И. [33] предлагают добавление в среду для оплодотворения (среда Бринстера) гиалуронидазы в концентрации 10мкг/мл. При этом процент выхода эмбрионов увеличивается с 14 до 22,6% при достоверной разницы.
Экстракорпоральное оплодотворение ооцитов включает ряд процессов, обеспечивающих слияние гамет: контакт и пенетрацию окружающих ооцит сперматозоидами, проникновение через зону пеллюцида, слияние мембран ооцита и сперматозоида, слияние пронуклеусов.
В первых опытах по оплодотворению оплодотворяемость не превышала 20%. В 1982 году впервые был получен теленок после оплодотворения тубального ооцита [11]. При этом процесс оплодотворения происходил в среде Тироде Б. По данным большинства авторов оплодотворяемость тубальных ооцитов колеблется от 48 до 70% при дроблении яйцеклеток на уровне 10-40%. В настоящее время к оплодотворению тубальных ооцитов прибегают редко. Вся работа по получению эмбрионов in vitro проводится с изолированными клетками, т.е. с ооцитами, выделенными из фолликулов.
В 1983 году родился первый в СССР теленок после оплодотворения созревшего in vitro фолликулярного ооцита. Каждому реципиенту пересаживали по несколько 2-4 клеточных эмбрионов. В результате такой трансплантации и родился живой теленок. Однако трансплантация зародышей на такой стадии требует хирургического вмешательства, поскольку эмбрионы в таком возрасте необходимо трансплантировать в яйцевод, что существенно усложняет процедуру пересадки. Поэтому основным направлением исследований в последнее время является получение эмбрионов на предтрансплантационных стадиях, пригодных для трансплантации нехирургическим путем.
Начальным этапом таких работ в бывшем СССР явилось использование промежуточных хозяев и в частности яйцеводы крольчих, т.е. после экстракорпорального оплодотворения зиготы помещались в лигатированные яйцеводы ложно беременной крольчихи, где они и развивались до стадии морулы-бластоцисты. После извлечения и оценки жизнеспособности их трансплантировали синхронным по циклу реципиентам. Другим вариантом такой работы было осеменение созревших in vitro ооцитов в половых путях крольчихи. Следует отметить, что в этом случае количество биологически полноценных, пригодных к трансплантации эмбрионов было в 2- 3 раза больше. Помимо этого было установлено, что приживляемость эмбрионов, полученных после оплодотворения в яйцеводе крольчихи, составила 27,3%, а от экстракорпорального – лишь 4,8% [30].
Однако, несмотря на положительные результаты, достигнутые в работах по оплодотворению ооцитов вне организма, сам метод оставался громоздким и не отличался достаточной эффективностью, в связи с чем исследования по его совершенствованию продолжаются до настоящего времени. Достигнутый за это время прогресс в изучении воспроизводительной функции, физиологии оогенеза и раннего эмбриогенеза крупного рогатого скота, разработке и производстве высокоэффективного оборудования, препаратов и питательных сред позволил поднять технологию in vitro на качественно новый уровень, Как известно, развитие половых клеток млекопитающих как in vivo так и in vitro всецело зависят от внутренних условий метаболизма и внутриклеточной регуляции, что в свою очередь обеспечивается полноценностью окружающей клетку питательной среды и эффективностью транспортировки через мембрану клетки необходимых компонентов, участвующих в процессах роста, развития и дифференцировки клеток.
Как показали исследования Campbell K. et. al [138], одна из основных ролей в транспорте извне и во внутрь клетки принадлежит интегринам.
