бластоцист был достоверно выше при плотности ооцитов 2:1 по сравнению с группами с плотностью 0,5:1 и 1:1.
Особенно остро вопрос оптимизации питательных сред применительно к условиям культивирования ограниченного количества ооцитов встал с разработкой и широким внедрением в практику получения эмбрионов в системе in vitro путем трансцервикальной пункции фолликулов с использованием ультразвукового зонда, когда получают единичные клетки и их ограниченное количество.
Целью наших исследований являлось изучение влияния соотношения ооцит/объем, ооцит/площадь культивирования на эффективность получения эмбрионов в культуре in vitro.
Таблица 102 - Влияние соотношения ооцит/объем на эффективность получения эмбрионов в системе in vitro при площади культуральной поверхности 3.14 см²
| Объем среда, мкл | Кол-во ооцитов, n | Соотношение ооцит/объем | Количество дробящихся зародышей | Количество Мо+ Бл. п-% | Количество Бл, п-% |
|---|---|---|---|---|---|
| 100 | 10 | 1/10 | 5-50,0 | 2-20,0 | 1-10,0 |
| 25 | 1/4 | 12-18,0 | 5-20,0 | 3-12,0 | |
| 50 | 1/2 | 18-36,0 | 5-10,0 | 2-4,0 | |
| 100 | 1/1 | 15,0-15,0 | 7-70,0 | 2-2,0 | |
| 200 | 10 | 1/20 | 5-50,0 | 1-10,0 | — |
| 25 | 1/8 | 14-56,0 | 5-20,0 | 3-12,0 | |
| 50 | 1/4 | 22-44,0 | 9-18,0 | 7-14,0 | |
| 100 | 1/2 | 31-31,0 | 6-6,0 | 4-4,0 | |
| 300 | 10 | 1/30 | 3-30 | 1-10 | |
| 25 | 1/12 | 13,0-52,0 | 5-20,0 | 3-12,0 | |
| 50 | 1/6 | 25-50,0 | 16,0-32,0 | 7-14,0 | |
| 100 | 1/3 | 35-35,0 | 4-4,0 | 2-2,0 | |
| 400 | 10 | 1/40 | 3-30,0 | 1-10,0 | |
| 25 | 1/16 | 12-48,0 | 4-16,0 | 2-8,0 | |
| 50 | 1/8 | 20-40,0 | 9-18,0 | 5-10,0 | |
| 100 | 1/4 | 47-47,0 | 19-19,0 | 15-15,0 |
Культивирование ооцитов проводилось в культуральной чашке площадью 3,14 см² в объеме среды 100, 200, 300 и 400 мкл (табл.104), а также в чашке Петри диаметром 40 мм и площадью культуральной поверхности 12,6 см² (табл.105) в объеме среды 1,5; 2,5; 3,0 и 3,5 мл. Как показывает анализ представленных данных, более высокие результаты были получены при соотношении ооцит/объем 1:15-1:35 (при площади культуральной поверхности 12,6 см² и 1:4-1:12 (при площади культуральной поверхности 3,14 см²). При этом выход бластоцист колебался на уровне 10-15%, а уровень дробления составлял 43,0-53,0% и 40-56%, соответственно. В среднем данный показатель составлял 12 и 12,4% и 48,5-48,4%. При всех других соотношениях уровень дробления снижался на 9,5-12,8%, а выходбластоцист на 8,5-9,9%.
Таблица 103 - Влияние соотношения ооцит/объем на эффективность получения эмбрионов в системе in vitro при площади культуральной поверхности 12,6 см2
| Объем среды, мкл | Кол-во ооцитов, п | Соотношение | Кол-во дроб-cя, n-% | Кол-во Мо+ Бл, п-% | Количество Бл, п-% |
|---|---|---|---|---|---|
| 1500 | 10 | 1/150 | 3-30,0 | 1-10,0 | - |
| 50 | 1/30 | 23-46,0 | 7-14,0 | 6-12,0 | |
| 100 | 1/15 | 43-43,0 | 18-18,0 | 10-10,0 | |
| 150 | 1/10 | 68-45,3 | 22-14,7 | 13-8,7 | |
| 2500 | 10 | 1/250 | 3-30,0 | 12-12,0 | -- |
| 50 | 1/50 | 21-42,0 | 6-12,0 | 3-6,0 | |
| 100 | 1/25 | 50-50,0 | 15-15,0 | 15-15,0 | |
| 150 | 1/17 | 71-47,4 | 26-17,4 | 17-11,4 | |
| 3000 | 10 | 1/300 | 2-20,0 | 1-10,0 | - |
| 50 | 1/60 | 20-40,0 | 6-12,0 | 4-8,0 | |
| 100 | 1/30 | 53-53.0 | 22-22,0 | 12-12,0 | |
| 150 | 1/20 | 77-51,4 | 29-19,4 | 19-12,7 | |
| 3500 | 10 | 1/350 | 4-40,0 | 2-20,0 | - |
| 50 | 1/70 | 19-38.0 | 7-14,0 | 5-10,0 | |
| 100 | 1/35 | 48-48,0 | 21-21,0 | 14-14,0 | |
| 150 | 1/23 | 74-49,4 | 28-18,7 | 21-14,0 |
11.3. Влияние условий оплодотворения на его эффективность
Известно, что для успешного оплодотворения ооцитов, сперматозоиды млекопитающих проходят процесс созревания или капацитации. В естественных условиях этот процесс происходит в половых путях самок и заключается в изменении характера плавательной активности и преобразовании строения клеточных мембран на головке спермиев, после чего спермотазоид становится способным к пенетрации ооцита. Кроме этого характерными особенностями прохождения процесса капацитации является переход спермиев от прямолинейно-поступательного к «гиперактивному» и снова к прямолинейно-поступательному движению. По завершении капацитации отдельные спермии начинают агрегировать между собой.
Для в оплодотворения ооцитов использовали замороженно-оттаяную сперму. Для капацитации использовали разработанные нами питательные среды на основе ТС-199 и Тироде. В качестве капацитирующего агента использовался гепарин в различных концентрациях (50, 100, 150, 200 и 250 ед/мл). Эффективность капацитации определяли по активности спермы, агрегации сперматозоидов, уровню дробления и выходу жизнеспособных зародышей.
Таблица 104 - Показатели капацитирующие способности гепарина в зависимости от концентрации
| Концентрация | Продолжительность | Доля спермиев с | Доля |
|---|---|---|---|
| гепарина, | гиперактивного | гиперактивным | агрегированных |
| ед/мл | движения, мин | движением, % | спермиев,% |
| 50 | - | - | - |
| 100 | 30 | 15 | 5,7 |
| 150 | 30 | 28 | 27,5 |
| 200 | 100 | 75 | 45,0 |
| 250 | 135 | 80 | 57,0 |
