Культивирование ооцитов проводилось в культуральной чашке площадью 3,14 см² в объеме среды 100, 200, 300 и 400 мкл (табл.104), а также в чашке Петри диаметром 40 мм и площадью культуральной поверхности 12,6 см² (табл.105) в объеме среды 1,5; 2,5; 3,0 и 3,5 мл. Как показывает анализ представленных данных, более высокие результаты были получены при соотношении ооцит/объем 1:15-1:35 (при площади культуральной поверхности 12,6 см² и 1:4-1:12 (при площади культуральной поверхности 3,14 см²). При этом выход бластоцист колебался на уровне 10-15%, а уровень дробления составлял 43,0-53,0% и 40-56%, соответственно. В среднем данный показатель составлял 12 и 12,4% и 48,5-48,4%. При всех других соотношениях уровень дробления снижался на 9,5-12,8%, а выходбластоцист на 8,5-9,9%.
Таблица 103 - Влияние соотношения ооцит/объем на эффективность получения эмбрионов в системе in vitro при площади культуральной поверхности 12,6 см2
| Объем среды, мкл | Кол-во ооцитов, п | Соотношение | Кол-во дроб-cя, n-% | Кол-во Мо+ Бл, п-% | Количество Бл, п-% |
|---|---|---|---|---|---|
| 1500 | 10 | 1/150 | 3-30,0 | 1-10,0 | - |
| 50 | 1/30 | 23-46,0 | 7-14,0 | 6-12,0 | |
| 100 | 1/15 | 43-43,0 | 18-18,0 | 10-10,0 | |
| 150 | 1/10 | 68-45,3 | 22-14,7 | 13-8,7 | |
| 2500 | 10 | 1/250 | 3-30,0 | 12-12,0 | -- |
| 50 | 1/50 | 21-42,0 | 6-12,0 | 3-6,0 | |
| 100 | 1/25 | 50-50,0 | 15-15,0 | 15-15,0 | |
| 150 | 1/17 | 71-47,4 | 26-17,4 | 17-11,4 | |
| 3000 | 10 | 1/300 | 2-20,0 | 1-10,0 | - |
| 50 | 1/60 | 20-40,0 | 6-12,0 | 4-8,0 | |
| 100 | 1/30 | 53-53.0 | 22-22,0 | 12-12,0 | |
| 150 | 1/20 | 77-51,4 | 29-19,4 | 19-12,7 | |
| 3500 | 10 | 1/350 | 4-40,0 | 2-20,0 | - |
| 50 | 1/70 | 19-38.0 | 7-14,0 | 5-10,0 | |
| 100 | 1/35 | 48-48,0 | 21-21,0 | 14-14,0 | |
| 150 | 1/23 | 74-49,4 | 28-18,7 | 21-14,0 |
11.3. Влияние условий оплодотворения на его эффективность
Известно, что для успешного оплодотворения ооцитов, сперматозоиды млекопитающих проходят процесс созревания или капацитации. В естественных условиях этот процесс происходит в половых путях самок и заключается в изменении характера плавательной активности и преобразовании строения клеточных мембран на головке спермиев, после чего спермотазоид становится способным к пенетрации ооцита. Кроме этого характерными особенностями прохождения процесса капацитации является переход спермиев от прямолинейно-поступательного к «гиперактивному» и снова к прямолинейно-поступательному движению. По завершении капацитации отдельные спермии начинают агрегировать между собой.
Для в оплодотворения ооцитов использовали замороженно-оттаяную сперму. Для капацитации использовали разработанные нами питательные среды на основе ТС-199 и Тироде. В качестве капацитирующего агента использовался гепарин в различных концентрациях (50, 100, 150, 200 и 250 ед/мл). Эффективность капацитации определяли по активности спермы, агрегации сперматозоидов, уровню дробления и выходу жизнеспособных зародышей.
Таблица 104 - Показатели капацитирующие способности гепарина в зависимости от концентрации
| Концентрация | Продолжительность | Доля спермиев с | Доля |
|---|---|---|---|
| гепарина, | гиперактивного | гиперактивным | агрегированных |
| ед/мл | движения, мин | движением, % | спермиев,% |
| 50 | - | - | - |
| 100 | 30 | 15 | 5,7 |
| 150 | 30 | 28 | 27,5 |
| 200 | 100 | 75 | 45,0 |
| 250 | 135 | 80 | 57,0 |
Как видно из анализа таблицы 104 по мере увеличения концентрации гепарина все показатели спермы возрастали. Так, если 50% концентрация гепарина не оказала заметного влияния на характеристику спермы то ее повышение увеличивало продолжительность гиперактивного движения с 30 (100ед/мл) до 135минут (250ед/мл), долю спермиев с гиперактивным движением с 15до 80%, а уровень агрегации спермиев с 5,7 до 57.0%.
Оплодотворяющую способность спермы определяли по уровню дробления и выходу полноценных зародышей на стадии морула-бластоциста (табл. 105)
Таблица 105 - Показатели оплодотворяющей способность спермы в зависимости от концентрации гепарина в качестве капацитирующего агента
| Концентрация гепарина, ед/мл | Оплодотворено ооцитов, n | Уровень дробления | Выход Мо-Бл | ||
|---|---|---|---|---|---|
| n | % | n | % | ||
| 50 | 70 | 8 | 11,4 | - | - |
| 100 | 150 | 74 | 49,3*** | 35 | 23,3 |
| 150 | 150 | 85 | 56,7*** | 29 | 19,3 |
| 200 | 100 | 34 | 34,0 | 12 | 12,0 |
| 250 | 90 | 16 | 17,8 | 9 | 10,0 |
Установлено, что более высокий уровень дробления и выход эмбрионов на стадии морула-бластоциста был получен при применении гепарина и канцентрации 100 и 150 ед/мл - 49,356,7 и 23,3-19,3%, соответственно. При увеличении концентрации гепарина до 200-250 ед/мл эти показатели снижались и составили соответственно 34,0-17,8 и 12,0-10,0%.
Для изучения влияния различных сред на оплодотворяемость ооцитов за основу было взято 4 среды: ТС199, Тироде, Тироде М (модифицированная) и среда Игла (табл. 106).
