скоростью 0,3 ° С/мин. и искусственной кристализации при -7 ° С было получено 55,6% стельностей. Аналогичные результаты получены в опытах Niemann H. et. al. /224/. При одноступенчатом насыщении эмбрионов 1,4 М глицерином и охлаждении со скоростью 0,3 ° -0,1 ° С/мин. до -35 ° С было сохранено 95,3% эмбрионов, а их приживляемость составила 51%. Некоторые исследователи /259/ охлаждали клетки до -4 ° С со скоростью 1 ° С мин. и до -35 ° С со скоростью 40 ° С/мин. После пересадки эмбрионов, замороженных по такой схеме, уровень стельности составил 52%. Охлаждение зародышей до -5 ° С со скоростью 9 ° С/мин. с последующей эквилибрацией в парах жидкого азота до -11,9 ° С и последующим охлаждением до -25 ° С со скоростью 2 ° С/мин. позволило сохранить только 45,6% зародышей, приживляемость которых составила 40% /211/.
Таким образом, соблюдение правильной технологии замораживания позволяет получить до 90% биологически полноценных эмбрионов, а их приживляемость довести до 50...55%. Однако, в производственных условиях эти правила нередко нарушаются, что приводит к снижению результативности метода.
По некоторым данным известно, что использование криоконсервации в производственных условиях рентабельно только в том случае, когда сохранность зародышей находится на уровне не менее 80%, а процент стельности реципиентов составляет 55-60% /193/.
Lehn-Jensen H. /197/ установил достоверное снижение уровня стельности реципиентов в случае, если время от извлечения до криоконсервации превышало три часа. Инкубация эмбрионов более пяти часов снижала уровень стельности на 33% по сравнению с эмбрионами, пересаженными в течение трех часов. К такому выводу пришли и некоторые другие исследователи /224/, которые отмечают, что с увеличением продолжительности хранения эмбрионов от извлечения до замораживания снижалась их жизнеспособность после оттаивания. Так, наивысший процент стельности реципиентов
был при хранении эмбрионов до замораживания не более 2-х часов. Хранение эмбрионов с 2 до 4 часов снижало их приживляемость до 21,9%. Следовательно, для успешной пересадки замороженно-оттаянных эмбрионов очень важно замораживать их сразу после извлечения и оценки качества.
Для создания и поддержки определенного режима криоконсервации зародышей в настоящее время разработан и внедрен в практику ряд электронных устройств, обеспечивающих заданный режим охлаждения. Среди таких устройств наибольшее распространение получили такие, как ″ Планер ″ (Англия), ″ Криоцель ″ (Германия), Миникул-АС-25 (Франция), а также Российского и Украинского УОП-1, УОП-2, ЗЭМ-4и МБИ-К.
Испытания показали достаточную надежность и эффективность данных приборов. Их использование позволяет получать в среднем до 80% жизнеспособных эмбрионов /93, 103/. Сравнительные испытания замораживателей R-204 (Англия), Миникул АС-25 (Франция) и УОП-1 (Украина) не выявило достоверных различий между ними. Так, сохранность эмбрионов находилась на уровне 80…90%, а приживляемость составляла около 46%. Выживаемость эмбрионов при использовании замораживателя ″ Криоцель ″ (Германия) находилась в пределах 88…95,5%, а их приживляемость составила 37,5%.
8.1. Влияние различных способов криоконсервирования и деконсервации эмбрионов на их сохранность
Согласно таблице 44 эмбрионы отличного качества при их заморозке с использованием этиленгликоля и оттаивании в растворе сахарозы. сохранили свою жизнеспособность в 100% случаев.
Таблица 45 - Сохранность эмбрионов в зависимости от криопротектора, способа оттаивания и качества эмбрионов
| Качество эмбрионов | Криопротектор | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| этиленгликоль | глицерин | |||||||
| Способ оттаивания | ||||||||
| стандартный | с сахарозой | стандартный | с сахарозой | |||||
| оттаяно, n | приг-х, n-% | оттаяно, n | приг-х, n-% | оттаяно, n | приг-х, n-% | оттаяно, n | приг-х, n- % | |
| Отличные | 357 | 327-91,6 | 97 | 97-100 | 341 | 312-91,5 | 102 | 92-90,2 |
| Хорошие | 108 | 97-89,8 | 53 | 51-96.2 | 150 | 135-90,0 | 41 | 37-90,2 |
| Удовл. | 36 | 16-44,4 | 33 | 23-69,7 | 29 | 11-37,9 | 20 | 15-75,0 |
Практически такие же результаты были получены в случае с эмбрионами хорошего качества (96,2%), что касается эмбрионов удовлетворительного качества, то наименьший уровень сохранности отмечен при использовании в процессе заморозки глицерина и этиленгликоля – при стандартном методе оттаивания – 37,9 и 44,4% соответственно. В целом же, как при криоконсервации зародышей в этиленгликоле так и при их криоконсервации в глицерине отмечена тенденция снижения сохранности при оттаивании клеток с использованием стандартного метода по сравнению с использованием сахарозы по всем уровням качества эмбрионов.
В таблице 46 приведены результаты исследования по изучению влияния на сохранность эмбрионов криопротектора при замораживании, способа оттаивания и стадии развития эмбрионов.
