до минимума затраты времени от убоя до постановки эксперимента и, что для максимального эффекта это время не должно превышать 1,5-2 часов [35, 98]. Однако для успешного проведения работ важно не только время доставки яичников в лабораторию, но и состав, и температура питательной среды, в которую они помещаются после вазоэктомирования. Так по данным Старостки В.В. [98] наиболее оптимальный режим для транспортировки яичников в лабораторию в течение 1,5-2 часов – +31-+370С. Индекс дробления в этих условиях на 21,7 и 13,7% выше по сравнению с доставкой яичников при температуре 0-6 и 18-230С соответственно. Аналогичные результаты получены в исследованиях Байбекова Ф.Р. [5], который отмечает, что наивысшая степень экспансии кумулюса (84,7%) наблюдалась в опытной группе, яичники которой транспортировались при температуре 370С. В группе, которая доставлялась в лабораторию при 40С экспансия кумулюсных клеток снижалась на 11% (при Р<0,05).
В исследованиях Martino A. et al. [210] вреда для созревания, оплодотворения и получения эмбрионов. Кратковременное воздействие температуры (100 и ниже) также особо отрицательного влияния не оказывает. Однако длительное воздействие таких температур негативно отражается на жизнеспособности клеток.
Как отмечалось выше, при более длительном хранении яичников (10-15 часов) основная часть ооцитов, сохраняемых таким образом, вообще не инициирует мейоз, поэтому в течение такого срока лучше сохранять изолированные ооциты с созданием для них соответствующих условий (5%СО2 в воздухе, максимальная влажность, а также присутствие необходимых энергетических и гормональных добавок).
Значительна вариабельность результатов культивирования и оплодотворения яйцеклеток вне организма в зависимости от индивидуальных особенностей доноров и в первую очередь – от возраста [47]. В отдельных исследованиях по этому вопросу отмечается, что если процент инициации мейоза и оплодотворяемость ооцитов у коров 5-6 лактаций, животных в
возрасте 1,5-2 лет и телочек 1-2 месяцев практически одинаковы, то при дальнейшем культивировании зародышей выявлено, что максимальное число эмбрионов на стадиях морулы и бластоцисты получено из ооцитов молодняка второй и третьей групп. Это подтверждается и исследованиями Журавель Р.И. [27], которая утверждает, что все 100% ооцитов от 1-2-месячных и 48-месячных животных реинициировали мейоз при постановке их на культивирование. Значительно хуже созревали клетки от старых коров (6-8 лет). Наименьший процент ооцитов с дегенерированными клетками обнаружен при культивировании клеток от животных 1-2 месяцев.
В тоже время существует и другое мнение. Gandolfi F. et al [159] исследовали сравнительную способность к созреванию in vitro ооцитов, полученных от неполовозрелых телят (10-14 недель) и от зрелых коров. Отмечается, что ооциты телят характеризуются меньшим диаметром по сравнению с ооцитами коров, низкой скоростью метаболизма пирувата и глутамина и пониженной белоксинтезирующей активностью, что рассматривается как факторы, снижающие способность ооцитов к созреванию in vitro.
Функциональное состояние яичников также имеет немаловажное значение при получении эмбрионов вне организма. Как известно, яичники претерпевают морфологические и физиологические изменения в течение всего полового цикла. Наименьший процент клеток с дегенерированными хромосомами был обнаружен, когда культивировали ооциты с плотным кумулюсом из яичников в стадии фолликулярного роста и наибольший при культивировании яичников с признаками овуляции. При этом разница была достоверна (Р<0.05) [27187, 209]. Немаловажным фактором, влияющим на эффективность получения эмбрионов in vitro, является фаза полового цикла, в которую отбирали яичники. Boedino A. et al [130] были проведены опыты с целью изучения эффективности использования яичников коров в лютеальную фазу. В первом опыте отбирали яичники в лютеальной фазе с активным желтым
телом и яичники в фолликулярной фазе. Количество ооцитов, выделенных из яичников, и уровень дробления эмбрионов практически не отличались 12 и 10; 84 и 89% в лютеальную и фолликулярную фазы соответственно, но выход бластоцист был значительно выше (Р<0,05) в 1-й группе против 2-ой. Во втором опыте отбирали яичники с желтым телом и без него. Среднее количество ооцитов на яичник с желтым телом и без него не отличались (15 и 15). Уровень дробления эмбрионов был выше (Р<0,01) в группе без желтого тела, по сравнению с группой с желтым телом (88 и 75% соответственно). Однако выход бластоцист в группе яичников с желтым телом был выше (Р<0,01) по сравнению с группой без желтого тела – 24 против 13%. Таким образом, приведенные данные показывают, что высокие результаты можно получить не только при использовании яичников в фолликулярной, но и в лютеальной фазе.
Лобченко В.А. [52] считает, что наиболее подходящим источником ооцитов в количественном и качественном отношении могут быть яичники животных в диэструсе или проэструсе, а яичники в метэструсе практически не пригодны для получения полноценных ооцитов, способных к дальнейшему развитию.
Наличие и размер фолликулов также оказывает влияние на полноценное развитие клеток [186]. Так, наиболее высокие результаты получены при культивировании ооцитов, полученных из яичников, в которых имелся один фолликул диаметром более 10 мм или более 10 фолликулов диаметром от 2 до 5 мм по сравнению с яичниками, у которых фолликул диаметром более 10 мм отсутствовал вообще или фолликулов диаметром от 2 до 5 мм было менее 10. Аналогичные результаты получены и в исследованиях других авторов [120, 234, 181].
Hаwk H. et al [170] так же считают, что размер фолликулов влияет на созревание ооцитов. В процессе проведенных ими опытов фолликулы разделялись на три группы: плохие, средние, хорошие, а ооциты на хорошие и плохие. Исследовали фолликулы диаметром менее 3мм, от 3 до 8 мм. При анализе
