уровня созревания, ооциты плохого качества показали самые низкие результаты, независимо от качества и диаметра фолликулов. Наиболее высокие результаты были получены при культивировании клеток из средних по качеству фолликулов диаметром 3-8 мм.
Stoсk A. и Smith K. [433] проведены аналогичные исследования, указывающие на влияние размера фолликула и кумулюса на созревание ооцитов. В эксперименте использовались ооциты из малых фолликулов диаметром менее 6 мм. Эти ооциты культивировались совместно с кумулюсом ооцитов из больших и малых фолликулов или с ооцитами без кумулюса из аналогичных по размеру фолликулов. По уровню дробления разницы между группами не установлено. Однако выход эмбрионов на стадии морула - бластоциста резко сокращался в среде с добавлением кумулюса ооцитов из больших фолликулов, что показывает на негативное влияние кумулюса ооцитов из больших фолликулов на развитие ооцитов из малых фолликулов.
Однако, некоторые из них считают, что созревание ооцитов не зависит от клеточного окружения, целостности ооплазмы и стадии хроматина. По мнению этих исследователей, существует тесная связь между типом кумулюса окружающего ооцит и созреванием ооцита [207].
Популяция ооцит – кумулюсных комплексов из антральных фолликулов гетерогенна в связи с тем, что в яичнике одновременно идут процессы роста и развития одних фолликулов и ооцитов и атрезия зрелых, что проявляется не только морфологически, но и в способности ооцитов созревать вне организма до стадии оплодотворения.
Критериев, которые позволили бы быстро отличить третический ооцит от растущего не разработаны, поэтому наиболее распространенным способом определения жизнеспособности ооцитов в настоящее время является их оценка по морфологическим показателям: состоянию кумулюса, его взаимосвязи с ооцитом, состоянию зоны и ооплазмы.
Первым признаком, говорящим о биологической
полноценности клетки, является наличие плотного многослойного кумулюса, плотно связанного с равномерной по толщине без видимых, изъянов апполесцирующей блестящей оболочкой, а также без видимых признаков гранулярной конденсации, мелкозернистой ооплазмой, равномерно заполняющей перивителлиновое пространство. Наличие каких либо отклонений говорит о снижении качества ооцита или его гибели.
Анализ результатов исследований Гузеватого О.Е. и др. [71] говорит о положительном влиянии предварительного отбора ооцитов. При этом уровень клеток, реаинициировавших мейоз и завершивших мейотическое созревание, был на 28,4 и 20,7% выше по сравнению с неотселекционированными.
Аналогичные показатели получены в исследованиях Байбекова Ф. [5]. Наивысшую степень реиниации мейоза, по кумулюсной экспансии (84,7%) показали ооциты, оцененные как хорошие. В группах средних и плохих уровень профилирации кумулюсных клеток составил 62,1 и 24,5% соответственно.
Разработанные в настоящее время методы культивирования ооцитов позволяют получать до 90% клеток на стадии «метафаза II». Однако при последующем оплодотворении и культивировании до предимплантационных стадий развивается не многим более 30%. Причиной этому служат многие факторы. В первую очередь необходимо понимать, что созревание ооцитов это комплексный процесс, включающий в себя мейотическое преобразование ядра, цитоплазматическое созревание и преобразование мембраны. Поэтому если для завершения ядерного созревания in vitro ооцитам достаточно обеспечить в средах энергетический и гормональный минимум, то цитоплазматическое созревание обеспечивается целым рядом биологически активных веществ, обеспечивающих в дальнейшем успешное оплодотворение яйцеклетки и развитие ранних зародышей до предимплантационных стадий.
Для полноценного созревания ооцитов в культуре in vitro необходимо создать условия, максимально соответствующие
естественным, т.е. тем, в которых обеспечиваются нормальное функционирование механизмов регуляции оогенеза in vivo. По мнению Кауффольда П. и др. [32] для создания таких условий требуется присутствие сыворотки крови, содержащей компоненты, способствующие выживанию и развитию клеток, среди которых особое значение имеют полипептидные факторы роста (ППФР), а именно: инсулиноподобный фактор (ИФР) и факторы роста эпидермиса (ФРЭ), тромбоцитов (ФРТ) и фибробластов (ФРФ). В настоящее время получены данные о действии ППФР только на процессы мейотического деления клеток.
Кривохарченко А. [43] установил, что сложные, содержащие аминокислоты, витамины и другие вещества среды могут применяться для культивирования ооцитов мышей без каких-либо белковых добавок. При этом процент эмбрионов, развивающихся до стадии вылупившейся бластоцисты, не снижается. Более высокие показатели выхода бластоцист были в том случае, когда использовались инактивированные сыворотки – 23,1% против 6,7% без инактивации [35].
В исследованиях Mingoti G. [216] оценивалась эффективность нескольких сывороток: фетальной крупного рогатого скота, коров в стадии проэструса, эструса или метаэструса. По результатам испытаний выявлено, что в целом добавление сывороток в питательную среду повышало синтез прогестерона и эстрадиола. Более высокий уровень дробления клеток достигнут при использовании эстральной сыворотки. Кроме этого установлено, что сыворотка стабилизирует рН, оказывает антипролеотическое действие и способствует более быстрой адаптации культивируемых объектов к условиям культуральных сред.
Игнатенко Л.В. и др. [31,191] провели опыт по изучению влияния фетальной сыворотки на созревание ооцитов. Применяли следующие системы созревания клеток: 1. Среда Паркера (МРМ) 20% фетальной сыворотки 40 мкг/мл гепарина. 2. Монослой клеток кумулюса сформированных за 144 часа в среде МРМ 15% фетальной сыворотки 40 мкг/мл гентамицина.
