Кондиционная среда, собранная с монослоя через 144 часа. В среде Паркера через 24 часа до стадии телофаза I – метафаза II созревало 80% ооцитов. Остальные 20% ооцитов имели признаки дегенерации.
Однако существует и другое мнение по поводу необходимости использования белковых добавок при получении эмбрионов вне организма. Так, Ymaschita T. et.al [276], Azato M. [120] утверждают, что бессывороточные среды показали большую эффективность при получении биологически полноценных эмбрионов по сравнению со средами с добавлением фетальной сыворотки.
Такого же взгляда придерживается Tornesi M. [262], в исследованиях которого различий между сывороточными и безсывороточными средами не обнаружено, хотя он и отмечает, что этот вопрос требует дальнейшего изучения.
Помимо сыворотки крови нормальному созреванию ооцитов, как считает, Гузеватый О.Е. [20] способствует введение в культуральную среду свежих или инкубированных гранулезных, а также кумулюсных клеток, что позитивно влияет не только на дозревание фолликулярных ооцитов до стадии метафаза II, но значительно увеличивает индекс дальнейшего дробления эмбрионов.
Fukui Y. et. al. [158] в своих исследованиях также показали необходимость присутствия в культуре in vitro клеток гранулёзы. Ооциты извлекали из фолликулов размером 1 – 5 мм и культивировали с клетками гранулёзы и без них. Клетки гранулёзы извлекали из фолликулов суперовулировавших коров – доноров в день охоты. Процент ооцитов, завершивших созревание с клетками гранулёзы и без них, практически не различался (70 и 73%), так же как процент оплодотворенных ооцитов и процент ооцитов с мужским пронуклеусом (94 и 91%). Однако дальнейшего развития эмбрионов из ооцитов, созревших без клеток гранулёзы, не отмечено (0/44), а эмбрионы из ооцитов, созревшие с клетками гранулёзы, развивались до морул и бластоцист в 36% случаев.
По результатам других исследований [105] установлено,
что в целом введение в культуральную систему клеток гранулёзы приводит к торможению созревания ядер. Так, до стадии телофазы и метафазы II созрело 60,8% против 35,5% при использовании свежих и 37,1% при использовании проинкубированных гранулёзных клеток. Однако, в то же время установлено, что применение проинкубированных гранулёзных клеток во время созревания привело к повышению процента оплодотворения и дробления по сравнению со свежими 49,4; 21,0% и 29,6; 9,1% соответственно.
Не менее важной составляющей синтетических питательных сред являются гормоны, активизирующие процессы созревания ооцитов в культуре in vitro. При этом по данным Сироткина А. и др. [92], действие вводимых гормонов носило различный характер. Так, ЛГ, СЖК и вазоцин стимулируют реиниацию и прохождение созревания; люлибирин, вазопрессин, окситоцин и малые дозы ФСГ на эти процессы не влияли, а пролактин и большие дозы ФСГ тормозили мейоз на стадиях диплотены метафазы 1. Авторы предполагают, что на ранних стадиях фолликулогенеза ФСГ стимулирует пролиферацию фолликулярных клеток и продукцию ими ингибиторов созревания ооцитов, а по мере созревания фолликул приобретает чувствительность к ЛГ, который блокирует секрецию и действие этого ингибитора, а также стимулирует ядерное созревание яйцеклеток. В пользу этого предположения свидетельствует факт стимуляции созревания сывороткой жеребых кобыл (СЖК), обладающей ФСГ и ЛГ активностью. В работе Arlotto T. [119] установлено, что при добавление в среду эстральной сыворотки эффект ФСГ/ЛГ активности теряется, но влияет на количество клеток в эмбрионе. Так, если при добавлении ФСГ/ЛГ в среду, где имеется сыворотка число клеток в расчёте на бластоцисту составило 117, то без ФСГ/ЛГ их количество возрастало до 125.
Brackett B. et.al. [135], анализируя влияние гормонов на эффективность созревания ооцитов, отмечают, что добавление в раствор бычьего гормона роста активизирует ядерное созревание по сравнению с ФСГ, эффективность которого значительно
ниже. Однако в присутствии совместно с ингибитором протеинкиназы. А его стимулирующая активность значительно возрастает. Не менее важную роль гормон роста оказывает и на цитоплазматическое созревание клеток [135].
К настоящему времени собрано значительное число данных об участии пролактина (ПРЛ) в регуляции фолликуло- и оогенеза, в которых показано положительное его влияние на ядерное созревание ооцитов, окруженных клетками кумулюса [119]. В исследованиях Torner H. et al. [261] пролактин в дозе 50 мг/мл положительно повлиял не только на выход ооцитов на стадии метафазы II, но и повысил уровень дробления, а также выход полноценных эмбрионов на 7-й день культивирования. В концентрации 25 мг/мл ПРЛ снижал на 11,6% долю ооцитов с дегенерированными хромосомами и увеличивал процент созревания яйцеклетки на 15,2% [190].
Выше отмечалось, что эффективность созревания и оплодотворения ооцитов вне организма зависит от функционального состояния яичников. Причина этого кроется в том, что гормональный состав фолликулярной жидкости зависит от стадии развития фолликула [189, 233]. В исследованиях Лебедевой И.Ю. и др. [48] проведено сравнение уровней пролактина (ПРЛ) и соматотропина (СТГ), участвовавших в регуляции фолликулогенеза у млекопитающих, в жидкости антральных фолликулов различного диаметра из яичников на стадиях фолликулярного роста и развитого желтого тела. Обнаружено возрастание концентрации ПРЛ в фолликулярной жидкости с увеличением диаметра фолликулов в яичниках на стадии фолликулярного роста. В яичниках с желтым телом такой зависимости не установлено. То же самое можно сказать и о концентрации соматотропного гормона, уровень которого был значительно выше в жидкости фолликулов диаметром 6-10 мм по сравнению с фолликулами диаметром 3-5 мм.
Углубленные исследования реакции клеток на гормональные воздействия позволили выявить сложную систему местных специфических факторов, осуществляющих контроль роста и дифференциации различных видов клеток путем
