изменения их протеолитической активности. Среди факторов межклеточного взаимодействия важную роль играют ростовые факторы или факторы роста (ФР) – биологически активные соединения, стимулирующие или ингибирующие деление и дифференцировку различных клеток и являющиеся основными переносчиками митогенного сигнала клетки [46, 105]. В отличие от гормонов ФР, как правило, продуцируются неспецифическими клетками, находящимися во многих тканях. Наиболее изученными факторами роста являются инсулиноподобный фактор роста (ИФР), эпидермальный фактор роста (ЭФР), фибринальный фактор роста (ФФР) и некоторые другие.
Как отмечает Kato H. et.al. [186] эпидермальный фактор роста, присутствующий в жидкости яйцеводов, стимулирует экспансию кумулюса, а также дробление зародышей после оплодотворения, но не оказывает практически никакого влияния на выход биологически полноценных эмбрионов, что подтверждается и другими исследователями [100, 159, 233]. Как отмечает Lorenzo P. [207] присутствие в среде фетальной или эстральной сыворотки это процесс только усиливает. Однако следует отметить, что системы культивирования, используемые в разных лабораториях, могут сильно отличаться как по типам и дозам гормонального и энергетического субстрата так и по типам основных питательных сред, объему культуральной среды и плотности ооцитов на единицу объема [158, 156, 170], а также использованию различных монослойных культур и клеток.
Технология получения эмбрионов вне организма, основанная на использовании яичников, полученных с мясокомбината, имеет один существенный недостаток – ооциты мы можем получить только один раз и только после убоя животного, что значительно снижает перспективу участия этого метода в селекционных программах. В связи с чем в последние годы особое внимание уделяется исследованиям, направленным на получения ооцитов посредством прижизненной трансвагинальной пункции фолликулов с использованием ультразонда. Данный метод позволяет собирать ооциты у
животных с известным генетическим потенциалом на любой стадии полового цикла без стимуляции множественного роста фолликулов с достаточно высокой повторяемостью сеансов аспирации без какого – либо ущерба здоровью животного. Однако в настоящий момент эффективность метода значительно варьирует и зависит от многих факторов [136,141].
Для успешного проведения работ по получению эмбрионов вне организма необходимо соблюсти два непременных условия: ооциты должны достичь стадии оплодотворения, а сперматозоиды пройти процесс капацитации. В естественных условиях сперматозоиды проходят подготовку к оплодотворению в половых путях самки. Вне организма капацитацию сперматозоидов проводят искусственно в питательных синтетических средах. Природа капацитации до конца не ясна [264], а время, требуемое для нее у разных видов животных не одинаково. Капацитация включает в себя удаление семенной плазмы с поверхности спермы, которая может маскировать рецептор, необходимый для взаимодействия «спермий - яйцеклетка». Маточная фаза капацитации изменяет плазменную и внешнюю акросомальную мембраны. Через деструктуированную мембрану вымываются протеолетические ферменты, необходимые для пенетрации сперматозоидом зоны пеллюцида.
Капацитация и последующая акросомная реакция необходимы для успешного оплодотворения ооцитов. После выдержки спермы в гипертонической среде происходит изменение характера движения спермиев, которое отражает нарастающую метаболическую активность, имеющую отношение к кислородному обмену в сперме при капацитации in vitro [128, 154, 166, 292].
По мнению многих авторов капацитацию сперматозоидов рекомендуется проводить при температуре +390С. Считается, что только при такой температуре индуцируется акросомная реакция. Однако опыты Uchockiene D. et. аl. [264] показали, что оплодотворение ооцитов спермой, инкубированной при +380С и +38,50С по сравнению с капацитацией при 390С повышало их
оплодотворяемость на 4,4 и 18,8% соответственно. Среди веществ, способных вызвать в условиях in vitro капацитацию и акросомную реакцию важную роль играют двухвалентные и одновалентные катионы Са2+, Mg2+, Na+, K+. Особый интерес вызывает применение растворов высокой ионной силы (КребсаРиггера, Тироде) и гепарина. Использование этих веществ при подготовке сперматозоидов быка способствовало получению потомства после оплодотворения. Так, добавление в сперму при капацитации гепарина повышает уровень дробления зародышей с 38,5% до 43,8% [135], что подтверждается и другими исследователями [56]. По их утверждению увеличение концентрации гепарина с 2 до 10 мкг/мл увеличивает пенетрацию ооцитов с 46,6% до 68,3%. В средах с высокой ионной силой и в присутствии гепарина наблюдалось набухание акросомы и везикуляция мембраны, характерные для капацитации. Наилучшие результаты были получены при использовании ионов кальция в стимулированных гепарином сперматозоидах быка [142] Авторы отмечают, что присутствие гепарина в среде для капацитации увеличивает концентрацию цитоплазматического Са2+ на 60%. Это увеличение происходит за счет поступления ионов кальция из вне через кальциевые мембранные каналы.
Важную роль в индукции капацитации и акросомной реакции играют отмывание сперматозоидов от семенной плазмы. Показано, что сперматозоиды кролика, быка и человека, отмытые от семенной плазмы самопроизвольно связывают экзогенную ДНК. Выделено три фазы взаимодействия ДНК со сперматозоидами: адсорбция, проникновение и элиминация [153].
Процесс капацитации сперматозоидов неразрывно связан с оплодотворением. Для оплодотворения созревших in vitro ооцитов, т.е. достигших стадий созревания метафазы II, в большинстве лабораторий используют следующие среды: Тироде, ХЭМ-Ф10 с добавлением эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, пенициллина, стрептомицина, гентомицина и других компонентов [30].
