Маленко Г.П. [56] предлагает созревшие in vitro ооциты и сперматозоиды инкубировать в среде Тироде с 6 мг/мл альбумина, 10 мкг/мл гепарина и 40 мкг/мл гентамицина. При таких условиях оплодотворяемость ооцитов составила 67,2%. Качанская В.В., Кузьмина Т.И. [33] предлагают добавление в среду для оплодотворения (среда Бринстера) гиалуронидазы в концентрации 10мкг/мл. При этом процент выхода эмбрионов увеличивается с 14 до 22,6% при достоверной разницы.
Экстракорпоральное оплодотворение ооцитов включает ряд процессов, обеспечивающих слияние гамет: контакт и пенетрацию окружающих ооцит сперматозоидами, проникновение через зону пеллюцида, слияние мембран ооцита и сперматозоида, слияние пронуклеусов.
В первых опытах по оплодотворению оплодотворяемость не превышала 20%. В 1982 году впервые был получен теленок после оплодотворения тубального ооцита [11]. При этом процесс оплодотворения происходил в среде Тироде Б. По данным большинства авторов оплодотворяемость тубальных ооцитов колеблется от 48 до 70% при дроблении яйцеклеток на уровне 10-40%. В настоящее время к оплодотворению тубальных ооцитов прибегают редко. Вся работа по получению эмбрионов in vitro проводится с изолированными клетками, т.е. с ооцитами, выделенными из фолликулов.
В 1983 году родился первый в СССР теленок после оплодотворения созревшего in vitro фолликулярного ооцита. Каждому реципиенту пересаживали по несколько 2-4 клеточных эмбрионов. В результате такой трансплантации и родился живой теленок. Однако трансплантация зародышей на такой стадии требует хирургического вмешательства, поскольку эмбрионы в таком возрасте необходимо трансплантировать в яйцевод, что существенно усложняет процедуру пересадки. Поэтому основным направлением исследований в последнее время является получение эмбрионов на предтрансплантационных стадиях, пригодных для трансплантации нехирургическим путем.
Начальным этапом таких работ в бывшем СССР явилось использование промежуточных хозяев и в частности яйцеводы крольчих, т.е. после экстракорпорального оплодотворения зиготы помещались в лигатированные яйцеводы ложно беременной крольчихи, где они и развивались до стадии морулы-бластоцисты. После извлечения и оценки жизнеспособности их трансплантировали синхронным по циклу реципиентам. Другим вариантом такой работы было осеменение созревших in vitro ооцитов в половых путях крольчихи. Следует отметить, что в этом случае количество биологически полноценных, пригодных к трансплантации эмбрионов было в 2- 3 раза больше. Помимо этого было установлено, что приживляемость эмбрионов, полученных после оплодотворения в яйцеводе крольчихи, составила 27,3%, а от экстракорпорального – лишь 4,8% [30].
Однако, несмотря на положительные результаты, достигнутые в работах по оплодотворению ооцитов вне организма, сам метод оставался громоздким и не отличался достаточной эффективностью, в связи с чем исследования по его совершенствованию продолжаются до настоящего времени. Достигнутый за это время прогресс в изучении воспроизводительной функции, физиологии оогенеза и раннего эмбриогенеза крупного рогатого скота, разработке и производстве высокоэффективного оборудования, препаратов и питательных сред позволил поднять технологию in vitro на качественно новый уровень, Как известно, развитие половых клеток млекопитающих как in vivo так и in vitro всецело зависят от внутренних условий метаболизма и внутриклеточной регуляции, что в свою очередь обеспечивается полноценностью окружающей клетку питательной среды и эффективностью транспортировки через мембрану клетки необходимых компонентов, участвующих в процессах роста, развития и дифференцировки клеток.
Как показали исследования Campbell K. et. al [138], одна из основных ролей в транспорте извне и во внутрь клетки принадлежит интегринам.
Интегрины – это семейство трансмембранных рецепторов, регулирующих внутри и внеклеточные механизмы восприятия (опознания) молекул и молекулярных соединений.
Интегрины находятся на поверхности гамет и принимают непосредственное участие в инициации взаимодействия между сперматозоидом и ооцитом во время оплодотворения.
В связи с чем, исследования последних лет направлены на создание условий для созревания, капацитации, оплодотворения и культивирования ранних зародышей, максимально приближенных к естественным условиям репродуктивного тракта самки и выявление основных факторов, оказывающих решающее воздействие на полноценное созревание, оплодотворение и развитие эмбрионов до стадии морулыбластоцисты.
Результаты, достигнутые разными группами исследователей с использованием различных систем культивирования, не поддаются анализу. Их эффективность, начиная от технологических элементов, используемых авторами, их квалификации, лабораторного обеспечения, питательных и газовых сред в каждой лаборатории варьирует в значительной степени, что в свою очередь ведет к значительной вариабельности результатов исследования [16].
Как было установлено, максимально снизить вариабельность выхода эмбрионов на стадии бластоцисты можно путем использования проверенных базовых сред и дополнительным добавлением к ним активизирующих процесс капацитации и оплодотворения химических компонентов (гепарин, кофеин, гипотаурин, ионофор и т.д.).
Другими элементами, влияющими на достижение положительного результата, являются: объем питательной среды, количество ооцитов на единицу площади, концентрация спермы и многие другие [135]. Так, например, Boguest W. et. al. [131] отмечает, что при присутствии в среде для оплодотворения глутатиола отмечается тенденция увеличения выхода зигот со вторым пронуклеусом. Кроме того, глутатиол характеризуется оксидантными свойствами, предохраняя мембрану от жирового
