переокисления. Положительное влияние глутатиола на формирование пронуклеуса отмечает и Soom A. et. al. [247]. Добавление глутатиола в среду для оплодотворения удваивало количество бластоцист (42% против 23%), а также уровень вышедших из зоны (20% и 9% соответственно). Как отмечает Taneja M. [259] эффективность глутатиола еще более возрастает в присутствии кофеина и гепарина. Выход бластоцист увеличивается по сравнению с контролем на 9,3% и 29,4% соответственно [259].
О важности присутствия кофеина в среде для оплодотворения говорит и опыт Brackett B. et al.[135], которые отмечают, что присутствие последнего значительно увеличивало уровень оплодотворяемости ооцитов. С этим соглашается и Abeydeera L. et. al. [116] в опытах которого присутствие кофеина увеличивало уровень пенетрации независимо от его концентрации.
Исследованиями Brackett B. et al. [135] установлено, если концентрация спермы от 1 до 8 млн. на 1 мл не влияла на уровень дробления, то концентрация 1 и 2х106 улучшала выход морул и бластоцист.
На процесс и эффективность оплодотворения вне организма огромное влияние оказывает качество и состав питательной среды, в которой происходит совместная инкубация ооцитов и спермиев. Наряду с качеством и составом сред для оплодотворения важное значение имеет время совместного инкубирования ооцитов со сперматозоидами. По мнению одних авторов ооциты со спермиями должны инкубироваться совместно 12-16 часов [62], других – 18 часов [140]. Согласно третьим существенной разницы между продолжительностью совместного культивирования в течение 5 часов и в течение 20 часов не обнаружено [160, 254].
Однако, несмотря на очевидный прогресс в повышении эффективности оплодотворения ооцитов вне организма, выход бластоцист, пригодных к пересадке, по-прежнему остается невысоким. Одним из факторов, влияющим на развитие
эмбрионов in vitro, является так называемый окислительный стресс, причиной которого является постоянно увеличивающееся количество продуктов окисления в процессе метаболизма в клетке. Одним из антиоксидантов, предохраняющим гаметы и эмбрионы от разрушительного воздействия окисления является гипотаурин, присутствующий в жидкости яйцеводов.
По результатам исследования Guader C. et al [152] установлено, что наиболее высокую эффективность гипотаурин оказывает в концентрации 0,5;1 и 2 мМ. Выход бластоцист в этом случае составил 40,9; 41,1 и 35,1% соответственно. Немаловажную роль в поддержании соответствующего рН среды играет и газовый состав атмосферы, окружающей эмбрионы при их культивировании in vitro.
Оплодотворенные яйцеклетки, культивируемые при 10% концентрации О2 в воздухе, хотя и дробились, но развивались достаточно медленно, что говорит об ингибирующем воздействии на профилиративные процессы в клетках высоких концентраций кислорода [221].
Анализ результатов воздействия различных концентраций кислорода на эффективность получения бластоцист in vitro в исследованиях Caamano J. [153] подтвердил вывод, сделанный выше. Если при концентрации О2 20% выход бластоцист составил 13,7%, то её снижение до 5% увеличило их выход практически в 2 раза (25,1%).
Nagao Y. [221] отмечает в свою очередь, что уровень концентрации кислорода зависит от количества эмбрионов в капле питательной среды. В его исследованиях установлено, что наиболее высокий выход бластоцист отмечен в том случае, когда при культивировании одного эмбриона уровень кислорода составлял 1%; 2-х – 2,5%; а 25 эмбрионов – 5%.
Уровень концентрации СО2 может зависеть от питательной среды. Так, по утверждению Farin C. et al. [156] использование среды Менезо требует меньшей концентрации СО2 по сравнению с ТС-199 (3% против 5% соответственно).
Много внимания при получении эмбрионов in vitro
уделяется вопросу энергетического обеспечения их роста и развития. Pinyopummiter T. et al. [233] отмечают, что только единичные зародыши достигли стадии дробления без экзогенных источников энергии, а глютамин как в отдельности, так и в сочетании с глюкозой не поддерживает раннее развитие эмбрионов. Лактат и пируват каждый в отдельности являются хорошими источниками энергии. Аминокислоты не поддерживают процесс дробления, однако в комбинации с лактатом кальция значительно увеличивают развитие бластоцист [231], с пируватом натрия такого не наблюдается. О том, что добавление в питательную среду витамина E ускоряло формирование экспандированных и вышедших из зоны пеллюцида бластоцист, отмечают и Olson S. et al. [229]. Ускоряет процесс появления 9-16 клеточных эмбрионов и формирование морул-бластоцист также добавление фетальной или эстральной сыворотки крупного рогатого скота [259, 155, 170, 195].
Выбор компонентов среды представляет особый интерес в плане стандартизации условий культивирования. Важная роль в этом отношении отводится фолликулостимулирующему гормону (ФСГ), который принимает самое непосредственное участие в инициации мейоза и развитии ранних зародышей даже в небольших количествах [122]. Так, снижение его концентрации с 0,05 И.Е./мл до 0,01 И.Е./мл не оказало отрицательного влияния на развитие оплодотворенных ооцитов до бластоцисты и количество в ней клеток. Baranao J. [122] добавлял ФСГ в дозах от 0 до 2000 мг/мл. По результатам исследования было установлено, что если выход морул увеличивался по мере увеличения концентрации гормона с 21,6% в контроле до 38,5% при концентрации 2000мг/мл, то выход бластоцист был наиболее высоким при уровне ФСГ 200 мг/мл. Далее их выход снижался.
Хорошим гормональным и энергетическим субстратом при культивировании эмбрионов in vitro является монослой из клеток репродуктивного тракта самок, а также клеток кумулюса, которые способствуют преодолению блока дробления на 8-16
