Биохимическая диагностика стельности
Amanda J. Cain и David Christiansen
Кафедра патобиологии и народной медицины, Колледж ветеринарной медицины, Государственный университет Миссисипи, Старквилл, Миссисипи, США
Вступление
Быстрая и точная диагностика стельности или отсутствия стельности имеет решающее значение для эффективного управления животноводством, особенно в молочной промышленности, где прибыльность в значительной степени зависит от репродуктивной эффективности стада коров.1 Ранняя идентификация небеременных коров, особенно если их можно выявить до следующей ожидаемой охоты, жизненно важна для поддержания оптимального межотельного интервала как в мясном, так и в молочном стаде. Традиционно производители в основном полагались на трансректальную пальпацию и/или трансректальное ультразвуковое исследование при диагностике беременности. Оба эти метода требуют специальной подготовки и технических навыков и обычно выполняются ветеринаром. Однако, ни один из них не может диагностировать беременность до появления охоты непосредственно после осеменения. Кроме того, многие географические районы испытывают нехватку специалистов по крупным животным. Это, в сочетании с желанием идентифицировать не стельных животных как можно раньше после осеменения, способствовало поиску надежных биохимических методов тестирования на стельность.2 В настоящее время доступен ряд биохимических тестов на стельность. Эти тесты выявляют связанные с беременностью гормоны или присутствие специфических для беременности молекул в материнском кровообращении и предлагаются в качестве приемлемой альтернативы трансректальной пальпации и трансректальной ультрасонографии. Однако, в отличие от трансректальной пальпации и трансректального УЗИ, в настоящее время эти тесты сами по себе не могут использоваться для точной оценки срока стельности.
При диагностике беременности путем трансректальной пальпации положительные признаки беременности ощущаются по репродуктивным структурам. Большинство крупных ветеринаров могут точно диагностировать беременность уже через 30–35 дней после осеменения, но уровень точности в значительной степени зависит от опыта ветеринара и обычно повышается, когда обследование откладывается до 40–50 дней после ИО. Ранняя эмбриональная смертность в результате трансректальной пальпации, особенно при использовании метода скольжения плодных оболочек, вызывала обеспокоенность и была предметом многочисленных исследований.
Риски, связанные с трансректальной пальпацией при диагностике стельности, полностью рассмотрены в главе 34.
С помощью трансректального УЗИ беременность может быть последовательно и точно диагностирована уже через 25 дней после осеменения. Максимальная чувствительность при диагностике беременности достигается на 26 у телок и 29 день у коров.4,5 По этой причине трансректальное УЗИ часто используется в качестве «золотого стандарта» при оценке других средств диагностики стельности. Хотя диагноз по УЗИ через 25 дней после осеменения ставится раньше, чем при трансректальной пальпации, трансректальное ультразвуковое исследование все еще не позволяет диагностировать отсутствие беременности до следующей ожидаемой охоты и, как и трансректальная пальпация, требует, чтобы ветеринар обладал значительными техническими навыками, чтобы обеспечить неизменно точные диагностические результаты. Кроме того, этот метод определения беременности требует значительных затрат на приобретение и обслуживание необходимого оборудования, и эти расходы должны быть возложены на производителя.
Идеальный тест на стельность позволил бы точно диагностировать как беременность, так и ее отсутствие через короткое время после оплодотворения, обладал бы превосходной чувствительностью (самка, которую тестируют на стельность, действительно стельная) , специфичностью (самка, которую тестируют на отсутствие стельности, действительно холостая) и точностью (пропорция истинных результатов) . Кроме того, идеальный тест был бы неинвазивным, чтобы при тестировании не создавать риск вызвать эмбриональную или внутриутробную смерть. Также, он был бы минимально затратным, не требовал бы высоких технических навыков или вовсе не потребует их, и его можно было бы легко и быстро выполнить на стороне желоба. Идеальный тест на беременность для крупного рогатого скота очень похож на тест на беременность на хорионический гонадотропин (ХГЧ) у женщин.
Тест на ХГЧ представляет собой простой ИФА (иммуноферментный анализ), который обнаруживает присутствие белка ХГЧ в моче беременных женщин. Его можно легко и недорого выполнить в домашних условиях, практически не требуя технических навыков. Доступные в продаже тесты ХГЧ имеют чрезвычайно высокую точность (> 99%), и некоторые из них могут быть выполнены уже через 8–10 дней после зачатия.6 К сожалению, коровы и телки не производят ХГЧ или любую аналогичную молекулу, которая может быть протестирована таким же образом.
Вместо этого были разработаны тесты для определения наличия определенных, связанных с беременностью молекул, таких как повышенная концентрация прогестерона, связанные с беременностью гликопротеины (PAG), фактор ранней беременности (EPF) и гены, стимулируемые интерфероном (ISG).2 Кроме того, по мере развития технологий и научных знаний о ранних сроках беременности, будет обнаружен ряд других молекул, которые могут однажды использоваться в качестве биомаркеров стельности у крупного рогатого скота.
Важное отличие, которое производители должны учитывать при выборе биохимических методов для определения статуса стельности, заключается в том, что анализы на прогестерон, PAG, EPF и ISG более точны при обнаружении небеременных самок, чем беременных. Следовательно, эндокринные тесты на беременность часто имеют отличную специфичность (> 90%), но чуть менее желательную чувствительность. Это имеет большое экономическое значение, поскольку самкам в режиме интенсивного производства, которых ошибочно идентифицируют как холостых, часто вводят простагландины в попытке начать новый цикл и сократить время до следующего осеменения. Эта инъекция простагландина, конечно, вызовет аборт у стельных коров, и, поскольку средняя стоимость потери стельности у молочной коровы в Соединенных Штатах оценивается в 555 долларов, существует серьезный стимул для минимизации случаев ятрогенной потери эмбриона и плода.7
Аналогичным образом, еще одним препятствующим фактором при попытке идентифицировать беременность вскоре после оплодотворения является естественная потеря беременности. Процент оплодотворяемости у крупного рогатого скота, как правило, высокий (> 90%), и поэтому основной причиной репродуктивных потерь является эмбриональная или внутриутробная смерть.8,9 Ранняя эмбриональная смерть, наступившая до 17-го дня беременности, составляет 20,5–43,6% потерь в сочетании с количеством неудач при оплодотворении.10 Однако, поздняя эмбриональная смерть, которая представляет собой потерю плода приблизительно от 17 до 42 дней стельности, по оценкам, в среднем составляет 12,8% у молочных коров и примерно 6,5% у мясных.13 Было подсчитано, что потери стельности от оплодотворения до предотельного срока у высокопродуктивных молочных коров могут приближаться к 60%.13 Для проверки надежности эндокринных тестов, проводимых на ранних сроках беременности, обычно диагноз стельности подтверждают с помощью трансректальной пальпации или ультразвукового исследования через несколько дней или недель после первоначального теста. Это создает окно, в течение которого может произойти потеря эмбриона или плода, что приводит к искажению данных из-за неправильной маркировки некоторых результатов как ложно положительных, поскольку корова действительно была стельной при первом тестировании, но потеряла стельность до подтверждающего обследования.
Концентрация прогестерона
Уровни прогестерона в сыворотке и молоке неуклонно повышаются после овуляции по мере роста и развития функционального желтого тела (ЖТ). У небеременных самок прогестерон снижается, поскольку ЖТ регрессирует и корова возвращается к течке. Однако у беременных самок уровень прогестерона должен оставаться повышенным в течение периода следующего ожидаемого эструса, поскольку ЖТ продолжает вырабатывать прогестерон для поддержания беременности.
Тест на концентрацию прогестерона работает при условии, что концентрация прогестерона в сыворотке и/или молоке останется повышенной во время следующего ожидаемого эструса, если корова стельная. Если корова холостая, концентрация прогестерона снизится до исходного уровня по мере регрессии ЖТ и развития нового доминантного фолликула3 (см. Главы 23 и 24).
Расхождения в прогестероновых тестах могут быть в значительной степени вызваны естественными различиями между особями в плане продолжительности лютеиновой фазы и эстрального цикла, так как уровни прогестерона остаются высоким, пока ЖТ присутствует во время диэструса.14 Кроме того, эмбриональная смертность в период между тестированием и подтверждением стельности путем трансректальной пальпации или трансректального ультразвукового исследования может дополнительно способствовать восприятию ошибочности теста.
Потенциальным недостатком при использовании прогестеронового теста в производственных условиях является то, что дата случки или осеменения должна быть известна по порядку, чтобы получить надежные результаты для отдельного образца, и, следовательно, применимость тестирования на прогестерон несколько ограничена.2,3 Как правило, образец молока или сыворотки берется через 21–24 дня после осеменения и анализируется с помощью радиоиммуноанализа (RIA), ELISA или, реже, методом латексной агглютинации (LA). Ряд тестов ELISA на прогестерон для сыворотки и молока доступен для производителей и продается как тесты для коров.
Тест на прогестерон очень надежен при выявлении небеременных самок, так как коровы с уровнем прогестерона в крови менее 1 нг/мл через 21 день после осеменения не могут быть стельными, но он несколько менее надежен при постановке положительного диагноза беременности из-за естественных различий в продолжительности эстрального цикла между отдельными животными.2 Было зарегистрировано выявление 95–100% нестельных животных при диагностике отсутствия стельности. Беременность была правильно определена в 68–97% случаев, при этом схемы исследования варьировались в зависимости от срока беременности, когда проводился тест, стандарта, с которым сравнивались результаты, а также от типа используемого анализа (ELISA, RIA или LA).15–20
Специфический протеин В беременности
Трофобласты жвачных животных высвобождают белки как индикаторы материнского признания жизнеспособного концепта. Эти белки, известные как PAG, являются аспарагиновыми пептидазами, и нет данных, что они являются протеолитически активными. Первым PAG, который был обнаружен, был специфический для беременности белок B (PSPB), ранее известный как связанный с беременностью гликопротеин 1. Этот белок продуцируется двуядерными клетками трофобласта в бычьей плаценте во время имплантации, хотя его точная роль в поддержании беременности еще не полностью понятна. Он может быть обнаружен в материнском кровообращении во время беременности с момента имплантации, часто сохраняясь в послеродовом периоде [21, 22].
Как следует из его названия, PSPB является специфичной для беременности молекулой и не обнаруживается в сыворотке неосемененных телок или холостых коров, что свидетельствует о том, что белок вырабатывается исключительно в ответ на функции концепта, а не в ответ на лютеиновую активность во время эстрального цикла.23 В отличие от хорионического гонадотропина лошади (ХГЛ) и ХГЧ, PSPB не выявляется в моче, и он обнаруживается только в молоке в течение интервалов, когда PSPB находится в очень высокой концентрации в плазме, например, вскоре после родов.
RIA (радиоиммунный анализ), способный надежно выявлять PSPB в материнской сыворотке уже через 24 дня после зачатия, был разработан Sasser et al. в 1986 году.
Тогда уникальным преимуществом тестирования PSPB было то, что, в отличие от тестов на прогестерон, не нужны даты осеменения для подтверждения стельности, так как белок специфичен для беременности и присутствует только во время беременности, достигая пика во время родов.
Кроме теста RIA для выявления PSPB существует также коммерчески доступный ELISA (BioPRYN™; Biotracking, Москва, ID, США). Этот анализ продается как в Соединенных Штатах, так и за рубежом как удобный и недорогой тест на беременность для использования как производителями, так и ветеринарами, и, кроме того, он позиционируется как имеющий точность, аналогичную трансректальному ультразвуковому исследованию. Он может быть использован уже через 30 дней после осеменения у коров и через 28 дней после осеменения у телок и требует идентичных концентраций для определения беременности или небеременности как и RIA.24,25 При одновременной проверке с трансректальным УЗИ ближе к концу эмбрионального периода, PSPB ELISA дал точность более 93%.26,27
На полезность PSPB в диагностике беременности отрицательно влияет относительно длительный период полураспада PSPB. PSPB может быть обнаружен в материнской крови до 80–100 дней после отела; поэтому производители должны соблюдать осторожность при использовании анализов PSPB для выявления беременности у коров, осемененных в начале послеродового периода.23,28 Кроме того, этот длительный период полувыведения может привести к ложноположительным результатам теста на беременность после аборта. Наконец, этот тест не имеет преимущества в диагностике отсутствия стельности до первого после осеменения эструса коровы
Ранний фактор беременности
EPF - это иммуносупрессивный гормон, который вначале можно обнаружить на детектируемых уровнях в материнской системе через 24– 48 часов после успешного оплодотворения, и он сохраняется в течение, по крайней мере, первой половины гестации.29 EPF действует как иммуномодулятор, защищая антигенно чужеродный концепт от отторжения организмом матери.30 Он вырабатывается материнскими тканями на предимплантационной стадии в ответ на присутствие концепта. Однако после имплантации эмбриональная ткань берет на себя ответственность за выработку EPF. Только жизнеспособный концепт, достигший стадии бластоцисты, способен производить EPF. Кроме того, EPF быстро рассеивается после смерти или удаления концепта. В отличие от некоторых PAG ( связанных с беременностью гормонов ), включая PSPB, EPF никогда не обнаруживался после родов.29 Сочетание этих признаков делает EPF потенциально очень полезным для определения беременности и распознавания эмбриональной смерти плода.
До открытия EPF и разработки теста для определения его присутствия было невозможно обнаружить беременность до имплантации, за исключением случаев инвазивной хирургии. Хотя диагностика беременности так скоро после осеменения кажется привлекательной, высокий уровень ранней эмбриональной смертности делает этот тест менее полезным. Производители, решившие использовать EPF для диагностики беременности на ранних сроках, должны повторно протестировать всех положительных коров на более позднем сроке, чтобы подтвердить наличие жизнеспособного концепта.
Ориентированный на производителя анализ EPF был бы очень ценным инструментом для выявления оплодотворения и беременности у коров в течение первых 4 недель стельности, поскольку уникальные свойства EPF делают его особенно полезным в рамках интенсивного производства. Он обнаруживается спустя 48 часов после оплодотворения, в отличие от PSPB, быстро исчезает при потере эмбриона или плода и, следовательно, может быть точно определен даже у коров, осемененных в начале послеродового периода, у которых может быть остаточный PSPB в крови.
Кроме того, при анализе на EPF будет гораздо менее вероятно получить ложноположительный результат из-за преждевременной потери беременности, чем при анализе на PSPB.31 Самое главное, тест EPF может точно определить наличие стельности у коровы задолго до ее следующего ожидаемого эструса.29
Первым и в настоящее время единственным надежным тестом на EPF является тест ингибирования розетки (RIT), в котором EPF в присутствии комплемента ( система сывороточных белков, постоянно присутствующих в крови в неактивном состоянии, активируется при попадании в организм антигенов) работает так, чтобы вызвать увеличение эффектов и титров антилимфоцитарной сыворотки при уменьшении образования розеток ( «розетки» образуются при фиксации эритроцитов на поверхности различных клеток) между лимфоцитами и гетерологичными эритроцитами.29 RIT для EPF очень точен и чрезвычайно полезен для выявления небеременных самок. К сожалению, тест RIT отнимает много времени и сложен в применении, и потому не практичен для регулярного использования в большинстве коммерческих хозяйств.
Недавно был разработан ориентированный на производителя тест для выявления присутствия EPF (EDP Biotech Company, Knoxville, TN, USA). Этот тест, анализ латерального потока фактора раннего зачатия (ECF), продается в качестве теста для крс на отсутствие беременности и, как сообщается, может обнаружить EPF в молоке или сыворотке в период от 48 часов до 20 дней после оплодотворения.32 Были высказаны опасения относительно точности теста ECF, проведенного на ранних сроках беременности. Ambrose et al.33 сообщили, что специфичность ECF на 7, 14 и 21 сутки после осеменения варьировала от 38 до 51%. Данные других исследований подтверждают эти выводы и делают вывод о том, что анализ латерального потока ECF не может правильно идентифицировать холостых коров со степенью точности, необходимой для большинства коммерческих молочных ферм.34–3 . Однако, разработка более надежного анализа для EPF может произвести революцию в диагностике ранней стадии стельности, особенно в молочной промышленности.
Интерферон-стимулированные гены
У крупного рогатого скота молекула, в первую очередь ответственная за материнское распознавание беременности, - интерферон (ИФН)-тау. Он секретируется клетками трофэктодермы концепта и действует паракринно на эндометрий матки, ингибируя пульсирующую секрецию простагландина (PG)F2α, тем самым эффективно подавляя лютеолиз и успешно поддерживая беременность.37 В отличие от молекул распознавания материнской беременности у некоторых других видов млекопитающих (т. е. ХГЧ у людей и ХГЛ у кобыл), ИФН-тау присутствует только в очень низких концентрациях на материнской периферии и поэтому в настоящее время не может быть напрямую выявлен в сыворотке или молоке. Таким образом, концентрация ИФН-тау в материнской крови не может быть использована для диагностики ранней беременности у крупного рогатого скота.38
В дополнение к своей роли в прерывании пути передачи сигнала, который регулирует высвобождение PGF2α, ИФН-тау также индуцирует активацию множественных дифференциально экспрессируемых ISG на лейкоцитах матери. В число этих ISG входят ген 1 и 2 устойчивости к миксовирусу (Mx1 и Mx2) и интерферонстимулированный ген белка 15kDa (ISG15), гомолога убиквитина.38–41 Экспрессия мРНК ISG15 на материнских лейкоцитах происходит по схеме, сходной с высвобождением ИФН-тау. Сначала она экспрессируется на 14-й день после зачатия, достигает пика между 17 и 18 днями и снижается с 21 по 26 дни.42 Однако, в отличие от ИФН-тау, ISG15 обнаруживается на периферии матери на ранних сроках беременности и потенциально может быть полезен в диагностике отсутствия беременности до следующей ожидаемой охоты.
