Воспроизводство крупного рогатого скота

Глава 80

Борьба с патогенами, переносимыми эмбрионами

Julie Gard

Кафедра клинических наук, Колледж ветеринарной медицины, Обернский университет, Оберн, Алабама, США

Введение

Эмбрионы подвержены загрязнению из многочисленных источников, включая донора, сперму, среды для культивирования и промывания, а также белки животного происхождения, используемые в составе сред. Эти патогены эмбрионов могут существенно влиять на клиническую эффективность технологий работы с эмбрионами. Согласно известному эпидемиологическому положению, именно сочетание факторов, связанных с возбудителем, хозяином и окружающей средой, определяет, будет ли в популяции особей преобладать здоровье или болезнь.¹ Об этом положении важно помнить при обсуждении патогенов эмбрионов. Разработаны три отдельных поколения технологий работы с эмбрионами, и с их появлением возникли серьёзные проблемы.² Каждая технология изменяет условия среды таким образом, что её применение может как усиливать, так и ограничивать распространение инфекционных агентов среди восприимчивого крупного рогатого скота. Поэтому эти технологии необходимо оценивать; такую оценку ежегодно проводит Консультативный комитет по вопросам здоровья и безопасности Международного общества трансплантации эмбрионов (IETS).² Всемирная организация по охране здоровья животных (OIE) принимает предложения комитета относительно стандартов перемещения эмбрионов для минимизации передачи болезней, стандартных протоколов и методов обработки для минимизации связи патогенов с эмбрионами, а также обоснованности экспериментальных методов, применяемых в настоящее время в технологиях работы с эмбрионами для повышения их жизнеспособности и сокращения потерь эмбрионов. При борьбе с патогенами важно учитывать все аспекты, однако профилактика (биобезопасность) лежит в основе предотвращения всех заболеваний.

Первые два поколения — производство эмбрионов, полученных in vivo и in vitro соответственно — широко применяются в товарном скотоводстве и фундаментальных исследованиях. В информационном бюллетене Международного общества трансплантации эмбрионов (http://www.iets.org/pdf/Newsletter/Dec12_IETS_ Newsletter.pdf) сообщалось, что в 2011 г. было проведено 104 651 процедур получения эмбрионов in vivo; в результате всего было собрано 732 862 эмбрионов, из которых 238 194 были трансплантированы свежими, а 309 806 — после замораживания. Для in vitro было получено 453 471 эмбрионов, пригодных для переноса; 373 836 из них перенесли

свежими, а остальные — после замораживания.³ Что касается нынешних показателей по клонированным эмбрионам, данные за 2010 и 2011 не приводились, однако, согласно информационному бюллетеню IETS 2010, в 2009 было выполнено 105 переносов свежих эмбрионов.⁴ Очевидно, это вызывало и продолжает вызывать обоснованное беспокойство: масштабы деятельности внутри стран и на международном уровне могут способствовать широкому распространению любого патогена, который хотя бы изредка передаётся с эмбрионами.

Первое поколение технологий работы с эмбрионами

Получение эмбрионов in vivo можно считать первым поколением технологий работы с эмбрионами. Первые методики были разработаны более 60 лет назад, как подробно описано в обзоре Betteridge.⁵ Сегодня эти базовые процедуры широко применяются в скотоводстве. Они включают стимуляцию суперовуляции у доноров, нехирургическое получение эмбрионов, их криоконсервацию и нехирургический перенос синхронизированным реципиентам.⁶ Широкое внедрение этих репродуктивных методов означало потенциально значимое изменение условий, способное как усилить, так и ослабить распространение местных или заносных патогенов животных.

За последние 30 лет многочисленные патогены крупного рогатого скота изучались в контексте получения эмбрионов in vivo и их переноса, чтобы определить, могут ли эти методы ослаблять или усиливать обычное распространение болезней в популяциях крупного рогатого скота.^7–9 Первоначально предполагалось, что неповреждённая блестящая оболочка защищает ранний зародыш от возбудителей инфекций, а правильное обращение с эмбрионами, имеющими неповреждённую блестящую оболочку, скорее снижает и зачастую устраняет распространение встречающихся в природе патогенов, чем усиливает его. Для проверки этих предположений использовали четыре основных подхода.¹⁰ Сначала эмбрионы с неповреждённой блестящей оболочкой подвергали воздействию in vitro различных патогенов. Их выбирали с учётом связанных с ними ветеринарно-правовых вопросов, например действующих программ борьбы с болезнями внутри страны и/или

действующих ограничений международной торговли. Например, OIE относит блютанг к болезням, о которых необходимо сообщать, ввиду его социально-экономического значения и большой роли международной торговли животными и продукцией животного происхождения.^11,12 Кроме того, для большинства серотипов вируса блютанга (BTV) характерна передача половым путём и через плаценту.^13–17 Поэтому вмешательство человека, препятствующее таким путям передачи или способствующее им, может существенно влиять на распространение BTV,¹⁸ что подчёркивает необходимость этих исследований.

Первый подход состоял в том, что эмбрионы подвергали воздействию изучаемого патогена. После искусственного заражения in vitro эмбрионы промывали с обработкой трипсином или без неё, а затем проверяли на наличие вируса с помощью анализа in vitro либо путём переноса эмбрионов реципиентам, свободным от болезни. За реципиентами и их потомством тщательно наблюдали, выявляя признаки инфекции. Результаты этих опытов были обнадёживающими: применявшиеся процедуры обработки эмбрионов, по-видимому, позволяли предотвращать распространение ряда важных возбудителей инфекций.^19,20 Были проведены и дополнительные исследования, чтобы подтвердить эффективность этих процедур обработки эмбрионов при использовании обычных протоколов их получения и переноса. В этих исследованиях эмбрионы получали от больных доноров — в острой стадии заболевания или в период выздоровления, — промывали или обрабатывали трипсином, а затем либо проверяли на наличие патогенов in vitro либо переносили реципиентам, свободным от болезни. За реципиентами и их потомством наблюдали, чтобы выявить передачу заболевания.^{7–10,19–21} Результаты этих исследований подтвердили, что процедуры обработки эмбрионов, ныне одобренные IETS²¹ и рекомендованные OIE,²² действительно эффективно препятствуют распространению некоторых инфекционных болезней в широком масштабе; OIE относит эти болезни к соответствующим категориям.^8,13,22,23 К таким процедурам относятся стандартные способы обработки эмбрионов, полученных in vivo, перечисленные в руководстве IETS²¹ и одобренные OIE, как уже отмечалось выше.²² В «Руководстве по обучению работе с эмбрионами» Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединённых Наций (FAO)²⁴ приводятся следующие рекомендации.

1. Эмбрионы следует промывать не менее 10 раз, обеспечивая при каждой промывке разведение не менее чем в 100 раз; для переноса эмбрионов между промывками каждый раз следует использовать новую пипетку.

2. Вместе следует промывать только эмбрионы от одного донора, причём за один раз — не более 10 эмбрионов.

3. Иногда, например когда требуется инактивировать или удалить определённые вирусы, такие как герпесвирус крупного рогатого скота (BHV)-1 и вирус болезни Ауески, стандартную процедуру промывки следует дополнить промывками с ферментом трипсином, как описано в руководстве IETS.²¹

4. После промывки всю поверхность блестящей оболочки каждого эмбриона следует осмотреть при увеличении не менее 50 ×, чтобы убедиться в её целостности и отсутствии прилипшего материала.²⁴

Протокол промывки и обработки трипсином при работе с вирусами, способными прикрепляться к эмбрионам, такими как вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (BHV-1), вирус болезни Ауески и вирус везикулярного стоматита, предусматривает пятикратную промывку эмбрионов в

фосфатно-солевом буфере с добавлением антибиотиков и 0.4% бычьего сывороточного альбумина, но без Ca²⁺ и Mg²⁺ (поскольку они подавляют действие трипсина), затем двукратную промывку раствором трипсина продолжительностью 30–45 с каждая и повторную пятикратную промывку солевым раствором с антибиотиками и 2% термически инактивированной сыворотки (а не бычьего сывороточного альбумина) для инактивации трипсина.²⁴ Активность фермента трипсина, используемого для приготовления промывочных растворов, должна быть такой, чтобы 1 g гидролизовал 250 g казеина за 10 мин при 25°C и pH 7.6. Стерильный раствор трипсина должен содержать 0.25% трипсина в сбалансированном солевом растворе Хэнкса без Ca²⁺ и Mg²⁺. В продаже имеются готовые к применению растворы. После промывки всю поверхность эмбрионов следует осмотреть под микроскопом при увеличении не менее 50×.²⁴ Кроме того, в целях борьбы с болезнями переносить или подвергать криоконсервации следует только эмбрионы с неповреждённой блестящей оболочкой, свободной от прилипшего материала.^21–24

Источники патогенов

Хотя некоторым аспектам получения эмбрионов, по-видимому, уделялось достаточно внимания, другие важные источники патогенов при получении эмбрионов изучены недостаточно. К ним относятся загрязнённые материалы (реагенты) животного происхождения и больные реципиенты.^25–27 Понятие «материалы животного происхождения» охватывает различные компоненты, в том числе добавки к питательным средам (например, g фетальную бычью сыворотку или бычий сывороточный альбумин), гормоны, которые могут использоваться для обработки доноров (например, g фолликулостимулирующий гормон гипофизарного происхождения), и ферменты для обработки эмбрионов (например, g трипсин). Подробные описания рисков, связанных с этими продуктами, уже публиковались.^26–28 В частности, бычий сывороточный альбумин маловероятен как источник патогенов, поскольку технология его производства, по-видимому, исключает выживание загрязняющих агентов.^29,30 Напротив, фетальная бычья сыворотка при отсутствии надлежащего контроля качества может быть источником посторонних бактерий, грибов или вирусов.^26,31 Наиболее распространённым загрязняющим агентом в фетальной бычьей сыворотке является вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV).^26,31–33

Известен ряд патогенов, передающихся от матери плоду через плаценту. К ним относятся BVDV, Neospora caninum , BTV, вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV) и Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (болезнь Йоне).^{13–17,34–36} Таким образом, при всесторонней оценке риска всегда следует учитывать всех возбудителей инфекций, способных вызывать временную, латентную или персистирующую инфекцию у донора и/или реципиента, которая может привести к заболеванию плода. В противном случае сбор и перенос эмбрионов, даже свободных от возбудителей, может привести к рождению больного потомства вследствие последующих внутриутробных инфекций.

По состоянию на декабрь 2012 года официальные рекомендации по биобезопасности при международном перемещении эмбрионов изложены в главе 4.7.5 Кодекса здоровья наземных животных в разделе «Управление рисками».³⁷ Эти общие стратегии были разработаны для того, чтобы перенос эмбрионов, полученных in vivo, не приводил к передаче возбудителей инфекций. Существуют три общие стратегии, позволяющие предотвратить передачу возбудителей инфекций при переносе эмбрионов, полученных in vivo, от

животных-доноров.^38,39 Каждая из них предполагает искусственное изменение условий среды, призванное препятствовать передаче возбудителей. Для крупного рогатого скота предпочтительным методом является обработка эмбрионов (то есть промывание или обработка трипсином),²¹ как описано выше, поскольку она относительно недорога, а её способность предотвращать распространение различных вирусов, бактерий и губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота подтверждена многочисленными исследованиями (см. таблицу 80.1).^8,22,37–39

Для крупного рогатого скота применяли и другие методы, включая обследование доноров, а также карантин и обследование реципиентов.³⁸ Обследование доноров на наличие заболевания во время сбора эмбрионов, а затем повторно через несколько недель или месяцев (пока эмбрионы хранятся в криоконсервированном состоянии) позволяет подтвердить, что доноры не являются возможным источником возбудителя. Обследование реципиентов после переноса эмбрионов и потомства после рождения служит биопробой: реципиенты и потомство выступают в роли животных-индикаторов. Однако для этого требуется длительный карантин животных. Кроме того, эти методы дорогостоящи и требуют проведения нескольких анализов, если необходимо выявить более одного заболевания, а также убедиться, что во время карантина не произошло случайного заражения. Поэтому с экономической точки зрения обработка эмбрионов является предпочтительным методом подтверждения их благополучия в отношении инфекций. Этот метод значительно облегчил международную торговлю эмбрионами благодаря преимуществам с точки зрения благополучия животных, борьбы с болезнями и экономики.³⁸

Категоризация возбудителей заболеваний, связанных с эмбрионами

Чтобы ещё больше облегчить международную торговлю эмбрионами, OIE при содействии подкомитета IETS по исследованиям в области охраны здоровья и безопасности составляет оценку, или категоризацию, известного риска передачи конкретного заболевания при переносе эмбрионов и ежегодно её обновляет.^22,23 Официальная категоризация заболеваний, связанных с эмбрионами, подробнее изложена в главе 1.4.7.14 Кодекса здоровья наземных животных в разделе «Категоризация болезней и патогенных агентов».²² Болезни категории 1 определены и перечислены в таблице 80.1.

В Кодексе здоровья наземных животных 1.4.7.14 указано, что к категории 2 относятся болезни, для которых накоплены убедительные данные о пренебрежимо малом риске передачи при условии надлежащего обращения с эмбрионами в период между сбором и переносом согласно Руководству IETS, но для подтверждения имеющихся данных требуются дополнительные переносы эмбрионов.²² К категории 2 относятся следующие болезни: блютанг (овцы), артрит-энцефалит коз и классическая чума свиней. К категории 3 относятся болезни или патогенные агенты, для которых предварительные данные указывают на пренебрежимо малый риск передачи при условии надлежащего обращения с эмбрионами в период между сбором и переносом согласно Руководству IETS, но для подтверждения предварительных результатов необходимы дополнительные данные экспериментов in vitro и in vivo.²² К категории 3 относятся следующие болезни или патогенные агенты: вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (козы), BVDV (крупный рогатый скот), Campylobacter fetus (овцы), ящур (свиньи, овцы и козы), Haemophilus somnus (крупный рогатый скот), маэди-висна

Таблица 80.1 Болезни или патогенные агенты категории 1, для которых имеется достаточно исследований, показывающих, что риск передачи при переносе эмбрионов, полученных in vivo, пренебрежимо мал при условии надлежащего обращения с эмбрионами в период между сбором и переносом.

Источник : глава 4.7.14 Кодекса здоровья наземных животных (http://www.oie.int/index. php?id=169&L=0&htmfile=chapitre_1.4.7.htm).

(овцы), Mycobacterium paratuberculosis (крупный рогатый скот), Neospora caninum (крупный рогатый скот), легочный аденоматоз овец, репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS), чума крупного рогатого скота (ликвидирована) и везикулярная болезнь свиней.²² К категории 4 согласно Кодексу здоровья наземных животных 1.4.7.14 относятся болезни и патогенные агенты, в отношении которых проведены или проводятся исследования, пока не позволяющие сделать вывод об уровне риска передачи, либо указывающие на то, что риск передачи при пересадке эмбрионов может быть существенным, даже если в период между получением и пересадкой с эмбрионами обращаются надлежащим образом в соответствии с руководством IETS.²² К категории 4 относятся следующие болезни и патогенные агенты: африканская чума свиней, болезнь Акабане (крупный рогатый скот), анаплазмоз крупного рогатого скота, катаральная лихорадка овец (козы), пограничная болезнь (овцы), BHV-4, Chlamydia psittaci (крупный рогатый скот, овцы), контагиозный метрит лошадей, энтеровирус (крупный рогатый скот, свиньи), ринопневмония лошадей, вирусный артериит лошадей, Escherichia coli 09:K99 (крупный рогатый скот), Leptospira borgpetersenii серовар Hardjobovis (крупный рогатый скот), Leptospira sp. (свиньи), нодулярный дерматит крупного рогатого скота, Mycobacterium bovis (крупный рогатый скот), Mycoplasma spp. (свиньи), эпидидимит овец ( Brucella ovis ), вирус парагриппа-3 (крупный рогатый скот), парвовирус (свиньи), цирковирус свиней (тип 2) (свиньи), скрепи (козы), Tritrichomonas foetus (крупный рогатый скот), Ureaplasma и Mycoplasma spp. (крупный рогатый скот, козы), а также везикулярный стоматит (крупный рогатый скот, свиньи).²²

Борьба с вирусными патогенами

Ограниченный объём главы не позволяет обсудить каждую болезнь из всех четырёх категорий. Поэтому далее в этой главе основное внимание будет уделено BVDV. Этот вирус имеет огромное значение из-за колоссального экономического ущерба, который он наносит мясному и молочному скотоводству: он снижает продуктивность вследствие ухудшения эффективности использования корма и сокращения выработки молока, а также вызывает гибель эмбрионов на ранних стадиях развития, аборты, мумификацию плодов, аномалии развития плодов, пневмонию и различные другие заболевания, ослабляющие животных.^28,40–47 Экономический ущерб от BVDV оценивался в исследовании Houe,⁴¹ согласно которому потери скотоводческой отрасли от BVDV составляли