Воспроизводство крупного рогатого скота

Глава 73

Контроль патогенов, передаваемых через сперму

Rory Meyer

Alta Genetics, Уотертаун, Висконсин, США

Введение

Контроль за патогенными микроорганизмами, передаваемыми через сперму крупного рогатого скота, является важной задачей в отрасли искусственного осеменения (ИО) крупного рогатого скота для предотвращения распространения болезни в разных регионах. Каждый год миллионы доз замороженной бычьей спермы производятся и распространяются как внутри Соединенных Штатов, так и по всему миру. Чтобы снизить риск распространения заболеваний, были установлены стандарты производства спермы от быков-доноров, и быки-доноры должны пройти жесткую программу тестирования, чтобы получить право на поступление в центр искусственного осеменения (ЦИО) и находиться под постоянным наблюдением на протяжении всего процесса сбора для производства спермы. По мере разработки новых тестов и проведения новых исследований программы тестирования быков-доноров в ЦИО постоянно оцениваются и совершенствуются, чтобы снизить вероятность распространения заболеваний через замороженную сперму.

В США Certified Semen Services, Inc. (CSS) устанавливает минимальные требования к тестированию быков-доноров, поступающих и проживающих в ЦИО для внутреннего распределения спермы. Дополнительное тестирование может потребоваться, если замороженная сперма быка-донора предназначена для международного экспорта и эти требования согласовываются Министерством сельского хозяйства США (USDA) и страной-импортером. Многие страны устанавливают свои собственные требования к тестированию, и они часто основываются на руководящих принципах, опубликованных Всемирной организацией здравоохранения животных (ВОЗЖ) при сборе и обработке спермы крупного рогатого скота. Одной из намеченных целей этих руководящих принципов ВОЗЖ является поддержание здоровья животных в ЦИО на уровне, допустимом для международного распространения спермы с незначительным риском заражения других животных или людей патогенами, передаваемыми через сперму.¹

Обычно быки-доноры и животные, предназначенные для использования в качестве подставных (на которых бык делает садку) , проходят тестирование в три этапа. Отобранные животные сначала проходят первичное тестирование перед тем, как попасть на карантинные объекты ЦИО. Второй этап состоит из группировки животных на период карантина и тестирование их в течение всего периода карантина и в конце периода.

И, наконец, как только животное попадает в постоянную популяцию в ЦИО, его проверяют ежегодно или раз в полгода для мониторинга статуса заболевания в ЦИО. В зависимости от требований различных экспортных рынков могут потребоваться дополнительные исследования.

В этой главе рассматриваются основные вызывающие озабоченность заболевания, которые могут передаваться через замороженную сперму крупного рогатого скота. Рассмотрены вовлеченные патогены и стратегии тестирования для минимизации риска передачи другим животным.

Вирусная диарея крупного рогатого скота

Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV) представляет собой одноцепочечный пестивирус с РНК, принадлежащий к семейству Flaviviridae. Это заболевание встречается во всем мире и является серьезным с точки зрения экономических последствий в инфицированных стадах. Клинические последствия различны и включают респираторные, желудочно-кишечные и репродуктивные симптомы, при этом основным источником инфекции являются персистентно инфицированные (ПИ) животные, присутствующие в стаде. ПИ-животные будут передавать BVDV восприимчивым животным в стаде, вызывая острую преходящую инфекцию, которая может привести к снижению оплодотворяемости у телок и коров. Несколько исследований показали, что BVDV может присутствовать в семени персистентно и остро инфицированных быков, способных передавать BVDV восприимчивому реципиенту.^2–5 Кроме того, есть сообщения о быках с инфекцированными семенниками, которые могут передавать BVDV с семенной жидкостью без виремии.^6,7

ПИ-животные являются результатом трансплацентарного заражения вирусом в период развития плода до 125 дней стельности. ПИ-быки могут нормально развиваться, но обладают иммунотолерантностью к штамму BVDV, которому подверглось животное.⁸ Бык с ПИ способен выделять BVDV в течение длительных периодов времени и в больших количествах, несмотря на то, что производит сперму с нормальной концентрацией, подвижностью и морфологией.² Эффект от использования спермы ПИ-быков и выявления восприимчивых самок значительный. Одно исследование показало, что у 12 из 12 серонегативных и вирус-отрицательных телок, искусственно осемененных спермой ПИ-быка, сероконверсия (образование антител) произошла в течение 2 недель после заражения.³

Другое исследование показало, что 161 из 162 коров, осемененных спермой ПИ-быка, были серопозитивными по сравнению с 95 из 143 коров, осемененных спермой других быков, наталкивая на вывод, что сперма от ПИ-быков способна передавать инфекцию BVD в восприимчивых стадах.² Это подчеркивает важность правильного отбора быков на предмет носительства до поступления в ЦИО.

Проверку на статус ПИ BVD быков до поступления в ЦИО осуществляют двукратным тестированием на антиген BVDV в сыворотке или цельной крови с интервалом не менее 10 дней. CSS (Центр сертификации спермы) требует, чтобы сыворотка или цельная кровь тестировались с помощью выделения вируса (VI - virus isolation), полимеразной цепной реакции (ПЦР) или иммуноферментного анализа (ELISA) с захватом антигена по первому образцу, собранному на ферме происхождения быка за 30 дней до его попаданиея в изолятор ЦИО с отрицательным результатом. У быка берут пробы для второго теста на антиген BVDV в сыворотке или цельной крови в течение периода изоляции, по крайней мере, через 10 дней после поступления в изолятор ЦИО с отрицательным результатом. Из-за влияния материнских антител на циркуляцию BVDV в сыворотке, быков младше 6 месяцев необходимо тестировать с использованием цельной крови в условиях изоляции.⁹

Восприимчивые быки, подвергшиеся воздействию BVDV, могут заболеть в острой или слабовыраженной форме в течение 6–21 дней после заражения. Период виремии также совпадает со значительным увеличением продукции антител к инфекционному штамму BVDV, что указывает на воздействие вируса.¹⁰ BVDV может быть обнаружен в сперме остро инфицированных быков на протяжении всего периода виремии, хотя уровни вируса в сперме значительно ниже, чем у персистентно инфицированных быков.^2,7,11 В результате уровни сероконверсии у животных, осемененных спермой остро инфицированных быков, у которых присутствует вирус, ниже, чем у животных, осемененных спермой ПИ-быков (1,8–15,4%).^4,5 Несмотря на более низкие показатели сероконверсии, тестирование на наличие острой инфекции у быков в ЦИО важно для предотвращения распространения BVDV в восприимчивых стадах. Требования к тестированию на острые инфекции BVDV аналогичны тестированию ПИ-быков. CSS требует, чтобы бык был протестирован на ферме с использованием VI, ПЦР или ELISA с захватом антигена в сыворотке или цельной крови в течение 30 дней после помещения в изолятор ЦИО с отрицательным результатом. Быка повторно тестируют не менее чем через 10 дней после помещения в карантин ЦИО с отрицательным результатом. Подобно тестированию на статус ПИ, у быков младше 6 месяцев необходимо проверять цельную кровь. Если результат положительный, быка изолируют от оставшихся в карантине животных и вновь исследуют, по крайней мере, через 21 день вместе с этими оставшимися животными. Если второй результат положительный, это указывает на то, что бык является ПИ и ему запрещается доступ в резидентное стадо. Если второй результат отрицательный, быков необходимо проверить в третий раз, по крайней мере, через 10 дней после второй пробы с отрицательным результатом до попадания в производственное стадо.⁹ В случае, если BVDV изолирован от быка с острой инфекцией, все партии спермы, собранные за 30 дней до и 30 дней после положительного результата, должны быть протестированы с помощью VI или ПЦР, прежде чем будут распределены.

Дополнительное тестирование на острые инфекции BVDV, рекомендованное ВОЗЖ, включает тест на обнаружение антител к BVDV.

Образцы сыворотки собираются до или в начале карантинного периода и, минимум, через 21 день после поступления в изолятор. Сероконверсия указывает на заражение в период изоляции, и бык должен пройти повторное тестирование перед тем, как войти в резидентное стадо. ВОЗЖ также рекомендует ежегодно отбирать у быков пробы и тестировать их на антитела к BVDV для мониторинга сероконверсии, пока они являются резидентами производственного стада ЦИО.¹

Дважды сообщалось о быках с персистентной тестикулярной инфекцией (наличие вируса в семенниках) , которые были способны выделять вирусные частицы в сперму, несмотря на отсутствие виремического состояния и наличие циркулирующих антител к BVDV.^6,12 Считается, что это возможно тогда, когда образование антител было вызвано первоначальной инфекцией, но вирус в семенниках был защищен от циркулирующих антител за счет гематосеменникового барьера. В обоих отчетах сказано, что эти быки стабильно производили сперму, содержащую вирус, в течение длительного периода времени, хотя вирусная нагрузка в дозе осеменения была меньше, чем в сперме, полученной от ПИ-быков, но больше, чем в сперме остро инфицированных быков.⁷ Одно исследование показало, что осеменение трех телок замороженной спермой одного из указанных быков привело к сероконверсии у одной из трех телок.¹³

Имеются сообщения о быках с пролонгированной тестикулярной инфекцией (PTI), у которых антиген вируса BVDV в сперме обнаруживался в течение 2,75 лет после экспериментальных острых инфекций. Однако, BVDV можно было обнаружить в сперме только с помощью теста VI во время виремического периода инфекции, хотя инфекционный вирус можно было выявить в семенниковой ткани через 12,5 месяцев после заражения.^7,14 Положительный результат был обусловлен обнаружением нейтрализованного вируса с помощью ПЦР, но последующее исследование не смогло обнаружить инфекционный вирус через 17 дней после заражения с использованием VI спермы. Несмотря на это, один эксперимент продемонстрировал, что неочищенная сперма, собранная у одного из быков с положительным PTI через 5 месяцев после заражения, привела к сероконверсии у 6- месячного теленка при ее внутривенной инъекции.¹⁴ В другом исследовании повтор этого опыта не привел к сероконверсии у телят, инокулированных внутривенно сырой спермой, а опыты с использованием замороженной спермы PTI-быков для осеменения телок также не дали сероконверсий. Был сделан вывод о том, что риск передачи вируса в результате длительной тестикулярной BVDVинфекции, может быть незначительным, но для подтверждения этого вывода требуется дополнительная информация.⁷ Требования CSS заключаются в том, чтобы быки, содержащиеся в ЦИО, проходили тестирование на PTI одним из двух способов до выпуска спермы на рынок. Первый метод заключается в тестировании всех изолированных быков с помощью реакции нейтрализации BVDV в сыворотке. Быки, получившие положительный результат теста, должны иметь единый код партии замороженной обработанной спермы, проверенной с помощью VI или ПЦР. Второй метод состоит в том, чтобы необработанная замороженная сперма от всех изолированных быков, независимо от их статуса антител, была проверена с использованием VI или ПЦР и имела единый код партии. Любой бык, у которого обнаружена персистентная тестикулярная BVDV-инфекция, не имеет права на сбор спермы и ему не допускается в резидентное племенное стадо.⁹ В настоящее время нет рекомендаций относительно тестирования быков для определения их статуса PTI. По мере поступления дополнительной информации может потребоваться дополнительный анализ с дополнительными тестами.

Лептоспироз

Лептоспироз вызывается грамотрицательной бактерией группы спирохет, которая встречается у крупного рогатого скота, овец, коз, свиней и лошадей во всем мире. Это также зоонозное заболевание, и люди заражаются инфекцией при контакте с мочой пораженных животных. Leptospira interrogans является патогенной формой бактерий и имеет множество сероваров, основанных на антигенах клеточной поверхности. Клинические признаки у крупного рогатого скота включают гемолитическую анемию, снижение надоев и изменение качества молока, мертворождение и аборты.^15,16 В США к распространенным сероварам относятся серовар Leptospira interrogans Hardjo (L. hardjo), L. pomona, L. grippotyphosa, L. canicola и L. icterohaemorrhagiae. Крупный рогатый скот является носителем L. hardjo.

Хотя основным путем передачи лептоспироза является моча, исследования показали, что передача этого микроорганизма возможна через свежую и замороженную сперму.^17,18 Было показано, что добавление антибиотиков в разбавленную сперму эффективно контролирует количество лептоспиральных организмов, которые могут присутствовать в ней, не влияя на качество спермы, и снижает риск передачи через ИО.¹⁷

В Соединенных Штатах CSS требует, чтобы быки, входящие в ЦИО, были отрицательными при микроскопическом тесте агглютинации (MAT - тест микроскопической агглютинации) в соотношении 1:100 или демонстрировали низкий стабильный титр (отрицательным считается менее 1:400) при тестировании с интервалом не менее 2–4 недель в течение 30 дней после поступления в изолятор ЦИО для каждого из следующих сероваров: L. hardjo, L. pomona, L. grippotyphosa, L. canicola и L. icterohaemorrhagiae. Аналогичные тесты и результаты тестов должны быть получены от быков, находящихся на карантине, прежде чем они попадут на резидентный производственный объект, и тест повторяется с 6- месячными интервалами, пока бык находится на резидентном производственном объекте ЦИО.⁹ Из-за этих требований к тестированию быков, предназначенных для использования в ЦИО, вакцинация против лептоспироза не проводится, поскольку MAT не может отличить титры, которые являются результатом естественных инфекций от титров, вызванных вакцинами.

Бруцеллез

Brucella abortus - основной возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота, вызывающий аборты, задержку плаценты, орхит, эпидидимит и нарушение фертильности. В основном он передается при контакте с маточными выделениями после изгнания абортированного или доношенного плода, но также распространение возможно через молоко и сперму инфицированных животных. Быки выделяют микроорганизмы B. abortus в сперму во время острой фазы инфекции, после чего выделение прекращается или становится прерывистым.¹⁹ Это серьезное зоонозное заболевание человека, и многие страны внедрили программы по искоренению B. abortus с помощью вакцинации и стратегий тестирования и убоя. Министерство сельского хозяйства США объявило все 50 штатов свободными от бруцеллеза с 2009 года, хотя инфекции продолжают обнаруживаться в районе Большого Йеллоустоуна в штатах Айдахо, Монтана и Вайоминг. Для выявления антител к B. abortus доступно несколько серологических тестов. Для быков, поступающих в ЦИО, CSS требует отрицательного результата буферного теста на антиген Brucella (Card или BAPA) или теста на фиксацию комплемента (CF) за 30 дней до поступления на карантин ЦИО. Во время периода изоляции бык должен иметь отрицательный результат как по буферному тесту на антиген Brucella (Card или BAPA), так и на CF-тест, прежде чем он попадет на резидентный производственный объект, и те же тесты повторяются с 6-месячными интервалами пока бык находится в резидентном производственном объекте.

Если результаты теста неотрицательны, проверка может быть завершена с другим утвержденным серологическим тестом с отрицательным результатом; но окончательная классификация быка определяется должностными лицами регулирующих органов государства, в котором завершено тестирование.⁹

Туберкулез

Mycobacterium bovis является основным возбудителем туберкулеза крупного рогатого скота и представляет собой хроническое прогрессирующее заболевание, которое часто вызывает постепенное истощение пораженного животного. Он передается другим животным при вдыхании или проглатывании M. bovis через выдыхаемый воздух, мокроту, молоко, мочу и фекалии. Сообщалось о передаче туберкулеза в результате естественного спаривания с быками с поражениями половых органов, вызванными M. bovis, и этот организм был обнаружен в свежих и замороженных образцах спермы с помощью ПЦР.^20,21 Как и бруцеллез, туберкулез крупного рогатого скота является зоонозным заболеванием, и многие страны пытались искоренить его с помощью программ тестирования и убоя. В Соединенных Штатах Министерство сельского хозяйства определило большинство штатов как аккредитованные штаты свободные от туберкулеза, а остальные классифицированы как модифицированные предварительно аккредитованные штаты с установленными показателями распространенности менее 0,01%.²² В Соединенных Штатах контрольное тестирование крс на M. bovis проводится путем внутрикожной инъекции бычьего туберкулина в область каудальной складки у основания хвоста, и наблюдение за реакцией спустя 72 часа. У животных, у которых наблюдается ощутимая реакция, проводят сравнительный цервикальный тест с использованием бычьего и птичьего туберкулина с оценкой ответной реакции через 72 часа. Существует серологический тест, который измеряет реакцию гамма-интерферона на туберкулин крупного рогатого скота, но его использование ограничено только должностными лицами регулирующих органов.

Для быков, поступающих в ЦИО, CSS требует отрицательного внутрикожного туберкулинового теста за 60 дней до попадания в карантин. Повторный внутрикожный тест проводится, когда бык находится на карантине, и он должен быть отрицательным, чтобы бык поступил дальше в резидентный производственный объект. Этот же тест повторяют каждые 6 месяцев, пока бык является резидентом производственного объекта ЦИО.⁹

Кампилобактериоз и трихомониаз

Кампилобактериоз и трихомониаз являются венерическими заболеваниями крупного рогатого скота, вызывающими бесплодие, раннюю гибель эмбрионов и аборты, а в случае трихомониаза - пиометру у инфицированных самок. Кампилобактериоз вызывается Campylobacter fetus подвид venerealis и является микроаэрофильной грамотрицательной бактерией. Трихомониаз вызывается Tritrichomonas fetus, жгутиковыми простейшими. Оба микроорганизма обитают на слизистой оболочке полового члена и препуция инфицированных быков, хотя они не вызывают каких-либо клинических признаков, а у быков нет симптомов и они заражаются любой инфекцией после спаривания с инфицированными самками. Состояние носительства существует для обоих заболеваний, почти исключительно у старых быков. Зараженные быки передают C. fetus venerealis и T. fetus при естественном осеменении самок, но возможна передача обоих заболеваний и через ИО.^23,24