Воспроизводство крупного рогатого скота

Глава 71

Криоконсервация семени

Swanand Sathe¹ и Clifford F. Shipley²

1Ветеринарный медицинский центр Ллойда, Колледж ветеринарной медицины Университета штата Айова, Эймс, Айова, США

2Программа по уходу за сельскохозяйственными животными и их использованию, Колледж ветеринарной медицины Иллинойсского университета, Урбана, Иллинойс, США

Введение

Искусственное осеменение (ИО) и криоконсервация сперматозоидов - это, вероятно, два великих достижения, которые произвели революцию в селекционной индустрии. Молочная промышленность, в частности, извлекла выгоду из обширного использования ИО, что позволило ускорить генетический отбор и улучшение стад. По оценкам, более 60% молочного скота в Соединенных Штатах разводится с помощью программ искусственного осеменения по сравнению с всего лишь 10% мясного скота. История криоконсервации спермы насчитывает полвека с открытия защитных агентов в яичном желтке для охлаждения и глицерина для замораживания спермы птиц и быков¹ , а также с момента рождения первого теленка от искусственного осеменения с использованием замороженных/ размороженных сперматозоидов.² Bratton и др.³ в своих полевых испытаниях продемонстрировали, что сперма крупного рогатого скота, замороженная до -79 °C и упакованная в сухой лед, может по-прежнему иметь высокую фертильность. С тех пор было исследовано несколько составов сред, называемых «разбавители», на основании их способности улучшать выживаемость и подвижность криоконсервированных сперматозоидов после оттаивания. Точно так же было исследовано несколько криозащитных соединений на предмет их защитной роли во время криоконсервации спермы. Нет никаких сомнений в том, что эта технология оказала огромное влияние на животноводство. Это во многом стало возможным благодаря замечательному успеху, достигнутому со спермой быков по сравнению со спермой других видов. В основном это связано с более высокой толерантностью спермы крупного рогатого скота к криопротекторам, таким как глицерин, по сравнению с другими видами, а также относительно небольшим количеством сперматозоидов, необходимых для зачатия.

Принципы криоконсервации

Механизмы повреждения клеток при криоконсервации

Методы криоконсервации спермы применялись на практике в течение последних 50 лет и обеспечивая длительное хранение спермы и, следовательно, ее практически неограниченную доступность.

Это способствует крупномасштабному запасу и распространению очень ценного генетического материала. Криоконсервация спермы подразумевает замораживание сперматозоидов до –196 °C - точки кипения жидкого азота - обычно используемой среды для замораживания и хранения. Это увеличивает жизнеспособность отдельных клеток за счет замедления скорости их метаболизма, и, соответственно снижения скорости использования субстратов и выработки токсинов. Сперма также может храниться после охлаждения до 5–8 °C и способна выживать в течение 24–48 часов без значительного снижения подвижности и даже до 96 часов без значительного снижения фертильности. Хотя этот способ может обеспечить эффективное и успешное кратковременное хранение, он оказывает негативное воздействие на сперматозоиды, проявляющееся в снижении уровня жизнеспособности, структурной целостности, подвижности и оплодотворяющей способности.^5,6 Криоконсервация, с другой стороны, предлагает возможность неограниченного хранения спермы в жидком азоте с приемлемым уровнем фертильности после размораживания. Криоконсервация может нанести ущерб функции сперматозоидов и фертильности даже при использовании последних достижений в технологии. Однако, повреждает не длительное хранение клеток при этих температурах, а скорее переход до этих температур и обратно к нормотермии, что приводит к криотравмам.⁷ Таким образом, изменения, происходящие во время замораживания, в основном являются ультраструктурными, биохимическими и функциональными. Это может ухудшить транспорт и выживаемость сперматозоидов в женских репродуктивных путях и снизить фертильность у домашних видов.⁸

Влияние криоконсервации на функцию и жизнеспособность спермы крупного рогатого скота хорошо изучено. Сперматозоиды обладают очень ограниченной собственной биосинтетической активностью и в основном зависят от катаболических процессов.⁹ Таким образом, чтобы остановить эти метаболические процессы, клетки необходимо охладить до температуры ниже –130 °C. Сперма, как и другие клетки организма, состоит из различных органелл, содержащих воду, которые могут образовывать внутриклеточные и внеклеточные кристаллы льда в процессе замораживания. При температуре около –5 °C внутриклеточная и внеклеточная вода остается незамерзшей в переохлажденном метастабильном состоянии. Однако, при температуре от –5 до –10 ° C во внеклеточной среде образуется лед, а внутриклеточная вода остается переохлажденной.

В этот момент скорость охлаждения должна быть достаточно низкой, чтобы позволить происходить клеточной дегидратации, избегая замораживания внутриклеточной воды, но достаточно быстрой, чтобы не подвергать клетку гиперосмотическому состоянию после обезвоживания. Сильное обезвоживание приводит к повреждениям, вызванным действием раствора, в результате денатурации макромолекул и чрезмерным сжатием клетки вплоть до необратимого коллапса мембраны.¹⁰ Еще один повреждающий эффект - это механическое давление формирующегося вокруг клетки льда, который будет сдерживаться очень ограниченным пространством незамерзших растворенных веществ.¹⁰ Зависимость жизнеспособности клеток от скорости замораживания, представляет собой перевернутую U-образную кривую. Основные причины повреждения клеток во многом зависят от скорости охлаждения, используемой во время процесса замораживания. Наиболее подходящей скоростью замораживания является самая быстрая, позволяющая замораживать внеклеточную воду без образования внутриклеточного льда. Быстрое охлаждение между 30 °C и 0 °C приводит к повреждению клеток некоторых сперматозоидов, так называемому «холодовому шоку», с пагубным воздействием на цитоскелет и связанные с геномом структуры и вызывающим разрыв цитоплазмы.¹¹ Холодовой шок также изменяет проницаемость различных мембранных структур на плазматической мембране, митохондриях и акросомах. Во время криоконсервации во внеклеточной среде образуются кристаллы льда, увеличивающие осмоляльность (концентрацию растворенных веществ) незамерзшей воды. Из-за этой разницы в осмотическом градиенте внутриклеточная вода диффундирует из сперматозоидов, обезвоживая клетку и плазматическую мембрану. При оттаивании это явление повторяется в обратном порядке: кристаллы внеклеточного льда тают, и вода начинает диффундировать внутрь клетки и регидратировать ее. Из-за таких резких изменений объема и осмотического напряжения может произойти необратимое повреждение и ультраструктурная деформация плазматической мембраны. Мембраны сперматозоидов состоят из множества фосфолипидов (в зависимости от вида), причем каждый фосфолипид имеет определенную температуру фазового перехода. Степень структурного повреждения этих мембран зависит от температуры и липидного состава мембраны.¹² Характеристики мембран, которые влияют на их чувствительность, включают соотношение холестерин/фосфолипид, содержание недислойных липидов, степень насыщения углеводородной цепи и соотношение белок/фосфолипид.¹ Некоторые липиды агрегируют в доменах гелеобразного (замороженного) липида, что исключает другие типы липидов, которые остаются в жидкокристаллическом (расплавленном) состоянии.^1,13 В конечном итоге это приводит к разделению фаз, при котором мембранные белки могут необратимо объединяться в кластеры, что приводит к утрате функции.¹⁴ Определенные температуры фазового перехода для различных фосфолипидов в мембране приводят к латеральной миграции с перегруппировкой компонентов мембраны и фазовым разделением липидов в плоскости мембраны. Латеральная миграция может создавать микродомены липидов, не образующих двухслойные слои, и может изменять среду, окружающую белок. При оттаивании эти изменения предрасполагают соприкасающиеся мембраны к слиянию и влияют на активность белка, что приводит к общему изменению проницаемости мембраны для воды и растворенных веществ.¹ Эта потеря проницаемости мембраны также мешает ионным насосам и приводит к притоку Са2+ в сперматозоиды (что угнетает их жизнедеятельность) , а также к потере активности мембранной АТФазы. Повреждение регуляторных систем Ca2+ в результате замораживания и оттаивания может предрасполагать сперматозоиды к неправильному времени капацитации и акросомной реакции, что способствует снижению оплодотворяющей способности криоконсервированной спермы быков.¹⁵

Роль разбавителей, используемых для криоконсервации

Наполнители или разбавители обычно добавляют для защиты спермы во время хранения в жидком или криоконсервированном виде. Независимо от вида, разбавители спермы призваны: 1) обеспечивать питательными веществами в качестве источника энергии; 2) содержать буфер против вредных изменений pH; 3) обеспечить соответствующее физиологическое осмотическое давление и концентрацию электролитов; 4) предотвратить рост бактерий; 5) защищать от холодового шока во время охлаждения; и 6) содержать криопротектор(ы) для уменьшения повреждений при замерзании.¹⁶

За последние 65 лет состав криозащитных сред для хранения спермы постоянно пересматривался, но основные ингредиенты остаются неизменными, при этом яичный желток и/или молоко и глицерин представляют собой незаменимые компоненты практически всех сред, используемых для сохранения спермы быков в жидкой или замороженном состоянии. Разбавители, используемые для разбавления спермы быков, обычно представляют собой яичный желток и/или буферы на основе обезжиренного цитрата/триса с добавлением простых сахаров и антибиотиков, с криопротекторами или без них, в зависимости от того, являются ли они одноступенчатыми или двухступенчатыми разбавителями. Эти компоненты обеспечивают приемлемую буферную емкость, осмоляльность и энергию в виде метаболизируемых субстратов, минимизируют рост бактерий, а также защищают сперматозоиды при понижении температуры.

Как упоминалось ранее, сперма может пострадать от холодового шока в результате внезапного снижения температуры, что вызывает структурные и биохимические повреждения. Этого можно избежать, медленно охлаждая сперму в присутствии защитных агентов (криопротекторов) . Phillips¹⁷ впервые сообщил о необходимости добавления яичного желтка в сперму крупного рогатого скота для обеспечения такой защиты. Последующие исследования показали, что яичный желток не только увеличивает оплодотворяющую способность сперматозоидов при температуре окружающей среды, но также предотвращает повреждение сперматозоидов во время охлаждения и замораживания.^18–21 С годами концентрация яичного желтка, добавляемого в разбавители, была снижена с 1:1 (объем/объем) до 20– 25% от объема, поскольку было показано, что это улучшает выживаемость сперматозоидов.^22,23 Было показано, что липопротеины низкой плотности (ЛПНП) в желтке играют важную роль в защите сперматозоидов, при этом в некоторых исследованиях сообщается, что ЛПНП сам по себе лучше для сохранения подвижности сперматозоидов после замораживания, чем цельный яичный желток.^24,25 Помимо яичного желтка, обезжиренное молоко также оказалось очень эффективным для защиты спермы во время хранения при 4 °C или криоконсервации,^26–28 и оно имеет тот же состав, что и цельное молоко, но содержит менее 0,1% липидов (в основном триглицериды). Защитным компонентом обезжиренного молока является не липидная фракция, а белковые компоненты, известные как мицеллы казеина. Существуют различные гипотезы о том, каким образом ЛПНП обеспечивают защиту. Было высказано предположение, что фосфолипидная фракция ЛПНП защищает сперматозоиды, образуя защитную пленку на их поверхности²⁹ или заменяя фосфолипиды мембран сперматозоидов, которые теряются или повреждаются в процессе криоконсервации.^30,31 Vishwanath и др.³² предположили, что липопротеины яичного желтка конкурируют с вредными катионными пептидами семенной плазмы (<5 кДа) в связывании с мембраной сперматозоидов и, таким образом, защищают сперматозоиды. Однако, недавние исследования подтверждают идею о том, что ЛПНП взаимодействуют с основными белками семенной плазмы быков, и это взаимодействие, по-видимому, имеет решающее значение для защиты сперматозоидов.³³ Семейство основных белков, известных как связующие сперматозоиды (BSP), обнаруженные в семенной плазме, связываются со спермой при эякуляции и изменяют мембрану сперматозоидов, удаляя холестерин и фосфолипиды. Это может отрицательно повлиять на способность спермы к хранению.

ЛПНП из яичного желтка, мицеллы казеина и сывороточные белки в обезжиренном молоке изолируют эти BSP, тем самым поддерживая подвижность и жизнеспособность сперматозоидов во время хранения.³⁴

Помимо яичного желтка и обезжиренного молока, разбавители, используемые для разбавления бычьей спермы, также содержат различные буферы, из которых одним из первых стал использоваться фосфат. Однако, цитрат натрия в значительной степени заменил фосфат из-за его превосходной особенности способствовать выживанию сперматозоидов при 5 °C. Цитрат также улучшает растворимость белковых фракций в яичном желтке благодаря своим хелатирующим свойствам. Многие цвиттерионные буферы, такие как трис [трис (гидроксиметил) аминометан], TES [N-трис (гидроксиметил) метил-2-аминоэтансульфоновая кислота] и титрованный трис TES (TEST), также были разработаны и испытаны в широком диапазоне pH и оказались аналогичными или превосходящими цитратные буферы. Из них разбавители на основе Трис в сочетании с яичным желтком были тщательно протестированы и повсеместно используются для увеличения объема бычьей спермы. Кроме того, считается, что белковые компоненты разбавителей с обезжиренным молоком обеспечивают их буферность. Из-за потенциального риска заражения ксенобиотиками исследования также начали сосредотачиваться на разбавителях без продуктов животного происхождения, таких как кокосовое и соевое молоко, и они имели удовлетворительные результаты. Недавнее исследование, сравнивающее трис-разбавитель с соевым молоком (SMT) с трис-разбавителем с яичным желтком (EYT), не показало значительных различий между сперматозоидами в плане подвижности после оттаивания, жизнеспособности, целостности мембран, целостности акросом и криокапацитации.³⁵

Сперматозоиды требуют энергии для движения и способны как к аэробному, так и анаэробному метаболизму.³⁶ Большинство разбавителей являются источником энергии в виде простых сахаров, таких как лактоза, манноза, фруктоза и арабиноза. Сахар также увеличивает осмотическое давление на среду и действует как криопротектор. Основным эффектом сахаров и полиолов (сахарные спирты или заменители сахара) , таких как глицерин, является их способность заменять молекулу воды в нормально гидратированных полярных группах, что помогает стабилизировать плазматическую мембрану сперматозоидов во время перехода через критические температурные зоны.¹³ Сахара, такие как глицерин, также увеличивают вязкость разбавителя и предотвращают эвтектическую кристаллизацию растворенных веществ, увеличивая склонность среды к стеклованию (переход в твердое состояние без фазы кристаллизации) - свойство, которое все чаще используется в средах для стеклования.³⁷

Большинство коммерческих разбавителей спермы крупного рогатого скота также содержат антибиотики для снижения скорости бактериального роста и его последующего пагубного воздействия на качество спермы. Бактерии присутствуют в половых органах и репродуктивном тракте быков независимо от репродуктивного статуса, и их порой трудно выявить даже при самом тщательном соблюдении гигиенических и санитарных процедур сбора и обработки. Кроме того, наличие яичного желтка и других компонентов обеспечивает хорошую питательную среду для роста этих организмов. Исторически пенициллин и стрептомицин были предпочтительными антибиотиками, используемыми в разбавителях бычьей спермы, поскольку они относительно безвредны для сперматозоидов и в комбинации подавляют широкий спектр микроорганизмов. Однако, эти антибиотики не способны контролировать рост таких микроорганизмов, как Campylobacter fetus subsp. venerealis и имеют сомнительную эффективность против Mycoplasma и Ureaplasma spp. которые могут пережить процесс замораживания. Продолжение использования этих антибиотиков также привело к развитию устойчивости бактерий. Из-за этих недостатков современные международные стандарты для разбавителей спермы отдают предпочтение протоколам, которые включают обработку спермы и разбавителя антибиотиками гентамицином, тилозином, линкомицином и спектиномицином (GTLS), поскольку они более эффективны в борьбе с микоплазмой, уреаплазмой, Campylobacter fetus, Haemophilus. somnus и Pseudomonas в сперме крупного рогатого скота.^38,39

Недавние исследования показали, что присутствие бактерий в сперме может отрицательно повлиять на целостность ДНК сперматозоидов, и скорость, с которой происходит это повреждение, положительно коррелирует с изначальной бактериальной нагрузкой и скоростью роста бактерий.⁴⁰ Присутствие комбинации антибиотиков GTLS также отрицательно сказывается на долговечности ДНК. Было показано, что использование антибиотиков класса хинолонов увеличивает долговечность ДНК сперматозоидов в образцах спермы, содержащих бактерии, и, таким образом, может представлять интерес с точки зрения продвижения альтернативных стратегий криоконсервации для улучшения репродуктивного результата.⁴¹

Роль криопротекторов в замораживании спермы крупного рогатого скота

В 1949 году Polge и др.⁴² сделали важное открытие, показав, что использование глицерина (проникающее растворенное вещество) может обеспечить защиту клеток при низких температурах. Это открытие часто называют определяющим моментом в становлении современной криобиологии спермы. Разработка протоколов криоконсервации семени быков, которые будут использоваться для искусственного осеменения в молочной промышленности, началась в 1950-х годах. Bratton и др.³ в полевых испытаниях продемонстрировали, что бычья сперма, замороженная до –79 ° C и помещенная в сухой лед, все еще может давать высокую фертильность. Открытие защитных свойств липидов яичного желтка и глицерина еще больше способствовало разработке разбавителей для криоконсервации спермы быков. Сумма этих открытий привела к разработке метода трис – яичный желток – глицерин для замораживания спермы быков, который теперь является стандартом.^28,43 Криопротекторы включаются в среду для криоконсервации для уменьшения физических и химических стрессов, возникающих при охлаждении, замораживании и оттаивании сперматозоидов,^10,44 и классифицируются как проникающие или непроникающие в зависимости от их способности проникать через мембраны. Проникающие криопротекторы (глицерин, диметилсульфоксид, этиленгликоль, пропиленгликоль) вызывают перестройку липидов и белков мембран, что приводит к увеличению текучести мембран, большему обезвоживанию при более низких температурах, снижению образования внутриклеточного льда и увеличению выживаемости в процессе криоконсервации.⁴ Они действуют как растворители и растворяют в среде сахара и соли.⁴⁴ Непроникающие криопротекторы (яичный желток, обезжиренное молоко, трегалоза, аминокислоты, декстраны, сахароза) не проникают через плазматическую мембрану и действуют внеклеточно. Они могут изменять плазматическую мембрану или действовать как растворенное вещество, понижая температуру замерзания среды и уменьшая образование внеклеточного льда.^45,46 Глицерин - проникающий криозащитный агент - является наиболее предпочтительным из криопротекторов, в основном из-за способности спермы крупного рогатого скота выдерживать гораздо более высокие уровни глицерина по сравнению с другими видами. Многочисленные исследования показали, что глицерин обеспечивает лучшую подвижность после оттаивания, меньшее повреждение мембран и наилучшую выживаемость по сравнению с другими криопротективными агентами.^47,48 После добавления глицерин легко проникает в клетку и снижает температуру замерзания среды до уровня ниже, чем у воды. Это уменьшает долю среды, которая замораживается одномоментно (at any one time), уменьшая влияние низкой температуры на концентрацию растворенных веществ и, следовательно, на разницу осмотического давления.^1,49,50 Он также обеспечивает каналы незамерзшей среды между кристаллами льда, в которых могут существовать сперматозоиды при низких температурах, и действует как солевой буферный агент.