Глава 8
Оценка племенной пригодности: базовое исследование спермы
Ричард М. Хоппер и Э. Хит Кинг
Кафедра патобиологии и популяционной медицины, Колледж ветеринарной медицины Университета штата Миссисипи, Старквилл, штат Миссисипи, США
Введение
Исследование спермы проводят по нескольким причинам, чаще всего после физикального обследования в рамках стандартной оценки племенной пригодности быка (BBSE). Саму BBSE проводят перед покупкой, ежегодно или дважды в год перед выпуском быков к коровам на случной сезон, а также в диагностических целях. Отдельное исследование спермы может проводиться для оценки прогноза после заболевания или травмы репродуктивной системы, а также у старого или травмированного быка с высокой генетической ценностью, сперму которого можно было бы использовать для искусственного осеменения. Эта глава посвящена главным образом микроскопическому исследованию спермы как части BBSE.
Базовое исследование спермы включает микроскопическую оценку подвижности и морфологии сперматозоидов. О количестве сперматозоидов или уровне их продукции судят по результатам измерения окружности мошонки (рассматривается в главе 7). Показано, что оценка морфологии имеет решающее значение, поэтому особое внимание будет уделено правильной оценке морфологии сперматозоидов и значению отдельных их аномалий.
Сперматогенез — динамический процесс, поэтому качество спермы, вырабатываемой быками, может резко измениться за несколько дней. В силу этого результаты исследования уже через несколько дней отражают лишь состояние на момент его проведения.
Исследование спермы в рамках стандартной BBSE
К получению и исследованию спермы быка приступают только после того, как он успешно пройдёт физикальное обследование и будет соответствовать установленным критериям. Если, несмотря на несоответствие этим критериям, продолжить обследование, это обесценит важнейшее требование к минимальной окружности мошонки или оценку правильности телосложения. Чтобы
исследовать сперму, необходимо безопасно и эффективно получить её образец. Подвижность сперматозоидов следует оценивать немедленно, однако препарат для исследования морфологии клеток можно приготовить и изучить как сразу, так и позднее.
Получение спермы
Сперму можно получить путём электроэякуляции, ручной стимуляции внутренних половых органов через прямую кишку или с помощью искусственной вагины при использовании животного для садки. Кроме того, можно использовать внутреннюю искусственную вагину, помещённую во влагалище самки в состоянии течки.1,2 Образцы, полученные путём ручной стимуляции, у разных быков имеют неодинаковое качество,3 но этот метод может быть полезен для молодых быков, плохо реагирующих на электроэякуляцию. Искусственную вагину и животное для садки обычно используют только на станциях искусственного осеменения для получения спермы, предназначенной для замораживания. Внутренняя искусственная вагина позволяет также оценить либидо. Однако из перечисленных методов электроэякуляция (EE) наиболее стабильно и надёжно позволяет получить образец для диагностики.
Наблюдения за быками, в частности за тем, как некоторые из них мычат во время электроэякуляции, вызвали опасения, что эта процедура может быть болезненной или по меньшей мере вызывать стресс. Было проведено исследование, в котором количественно оценивали уровни кортизола и прогестерона в сыворотке крови, степень избегания процедуры и выраженность вокализации.4 Хотя результаты оценки избегания оказались неоднозначными, повышение уровней кортизола и прогестерона в сыворотке крови, а также учащение вокализации в некоторой степени подтверждали эти опасения. Однако недавнее выяснение роли вещества P — нейропептида, участвующего в интеграции болевых ощущений, а также реакций на стресс и тревогу, — показало, что электроэякуляция сама по себе не вызывает боли.5
Все применяемые в настоящее время модели электроэякуляторов работают по сходному принципу, хотя различаются по способу управления и реакции быков на их применение. В одних моделях для ручного повышения напряжения используется реостат, в других напряжение повышается по заданной программе, а по меньшей мере одна модель позволяет выбрать любой из этих режимов. Поэтому выбор модели обычно определяется личными предпочтениями (рисунок 8.1).
С технической точки зрения за более чем 50 лет с момента выдачи первого патента (Marden, патент США № 2,808,834) способ подачи напряжения в электроэякуляторе мало изменился. Однако конструкция зондов постоянно совершенствовалась, в частности расположение электродов, размеры и форма ограничителя. Как правило, следует использовать зонд наибольшего диаметра, который можно без труда ввести в прямую кишку быка; более тяжёлые зонды, по-видимому, обеспечивают лучший контакт, чем лёгкие. Общий ориентир при выборе размера: для быков массой 544–907 kg используют зонд диаметром 7.5–cm, а для более крупных и взрослых быков — 9–cm.6 Более крупный зонд (9 cm), по-видимому, также лучше всего подходит для быков породы брахман (рисунок 8.2) и её помесей. Выпускаются и зонды меньшего размера (6–6.5 cm), которые часто необходимы для годовалых быков. Ограничитель зонда — это U-образный выступ на его задней стороне, который охватывает хвост, не даёт зонду смещаться из прямой кишки и поддерживает правильное положение электродов. Предпочтителен ограничитель, направленный вверх, поскольку для фиксации животного в станке часто используют заднюю перекладину. Если бык попытается лечь в станке, горизонтально расположенный ограничитель зацепится за заднюю перекладину и передний конец зонда сместится вниз. Хотя это редко приводит к серьёзному повреждению прямой кишки, такой ситуации следует избегать (рисунок 8.3).
Получить сперму быка методом электроэякуляции быстрее и легче помогают несколько приёмов, выполняемых во время физикального обследования. При пальпации внутренних половых органов быка через прямую кишку уделите ещё несколько минут массажу ампул семявыносящих протоков и надавливанию пальцами на уретральную мышцу и бульбоуретральную железу. Это способствует расслаблению полового члена; нередко у быка начинают выделяться капли предсеменной жидкости и спермы. Затем, прежде чем вводить зонд электроэякулятора, неплотно сожмите кисть в кулак и несколько раз подвигайте рукой вперёд-назад, чтобы вызвать утомление и расслабление прямой кишки быка. Это облегчает введение зонда. Описанные массаж и утомление
прямой кишки занимают всего несколько минут и, по-видимому, уменьшают реакцию быка на электростимуляцию и ускоряют получение спермы. Затем, по возможности одним плавным движением, введите зонд в прямую кишку, одновременно извлекая из неё руку.
После введения зонда в прямую кишку можно использовать либо заранее запрограммированный, либо управляемый вручную цикл стимуляции. Преимущество запрограммированного цикла в том, что оператор может заняться
другими задачами; кроме того, стимуляция подаётся с заданной циклической частотой, которая, как показывает опыт, эффективна для большинства быков. Ручное управление позволяет оператору уменьшить стимуляцию, если бык кажется чувствительным, или, наоборот, при необходимости ускорить циклы и повысить интенсивность стимуляции. Выбор модели электроэякулятора, опять же, во многом зависит от личных предпочтений. При ручном управлении первые два-три цикла стимуляции проводите медленно, внимательно наблюдая за быком. В зависимости от его реакции усиливайте стимуляцию при каждом следующем цикле: на пике воздействия сделайте паузу на счёт «тысяча один, тысяча два, тысяча три», затем снизьте интенсивность стимуляции для отдыха на один счёт и повторите цикл. Первые порции выделений не собирайте; дождитесь, когда семенная жидкость станет мутной. К этому времени половой член должен выдвинуться, и его удобно осмотреть на наличие дефектов. Его также можно захватить марлевой салфеткой: это улучшит обзор, поможет получить более чистый образец спермы и не даст половому члену втянуться обратно (рисунок 8.4).
Иногда эякуляция не происходит даже после полного цикла электростимуляции. В таком случае прекратите стимуляцию и дайте быку отдохнуть. Обычно в течение 2–3 мин отдыха сперма начинает самопроизвольно выделяться каплями из полового члена. Если после такого «отдыха» получить сперму не удалось, возобновите стимуляцию, проведя от двух до четырёх циклов с быстрым повышением интенсивности.
Как правило, сперму труднее получить у быков, которые находились с коровами и активно участвовали в случке в течение последних 24 часов. Нервные и агрессивные быки также часто вызывают затруднения. Если необходима седация, можно использовать ксилазин (20–50 mg внутривенно). Ацепромазин не следует применять, поскольку он затрудняет получение спермы и повышает вероятность её загрязнения мочой (уроспермии).
Сперму можно собирать в воронку, прикреплённую к ручке для сбора; при этом ёмкость можно поместить в тёплую водяную «баню» или иным образом теплоизолировать. Другой вариант — собирать сперму в стаканчик для кофе из пенополистирола. Такие стаканчики, по-видимому, достаточно хорошо защищают образец от умеренных температурных воздействий; поскольку они используются в сфере общественного питания, предполагается, что они чистые (стерильные?).
Макроскопическая оценка спермы
После получения сперму сначала следует оценить макроскопически. По степени её непрозрачности (или прозрачности) и цвету можно приблизительно судить о концентрации сперматозоидов. Очень концентрированные образцы выглядят как густые сливки, а сильно разбавленные — как разбавленное водой обезжиренное молоко. Желтоватый оттенок спермы может быть следствием загрязнения мочой; это можно подтвердить по запаху или с помощью тест-полоски для определения азота мочевины крови. Кроме того, при микроскопическом исследовании спермы, загрязнённой мочой, подвижность сперматозоидов быстро снижается или зачастую отсутствует с самого начала. С другой стороны, светло-жёлтый или золотистый цвет также бывает связан с очень высокой концентрацией сперматозоидов и присутствием рибофлавина,7 что часто наблюдается у многих быков джерсейской породы и некоторых быков породы ангус. Красный или коричневый цвет спермы обусловлен присутствием крови или её пигментов; источник такого загрязнения необходимо установить.
Оценка подвижности сперматозоидов
После быстрой общей оценки спермы небольшую «висячую» каплю помещают на предварительно подогретое предметное стекло и оценивают общую подвижность при малом увеличении микроскопа (40–200×). Густые, тёмные, быстро колеблющиеся завихрения свидетельствуют об отличной подвижности (то есть высокой скорости движения), высокой доле сперматозоидов с поступательным движением и высокой концентрации сперматозоидов в образце. Такой образец обычно оценивают как «очень хороший». Образец с более медленно движущимися завихрениями оценивают как «хороший». В образце с оценкой «удовлетворительно» завихрений нет, но наблюдается заметное движение отдельных сперматозоидов. В образце с оценкой «плохо» движение или колебания отсутствуют либо почти отсутствуют. Поскольку концентрация сперматозоидов влияет на оценку общей подвижности, при любых сомнениях в достоверности такой оценки, полученной при исследовании висячей капли на малом увеличении, следует оценить индивидуальную подвижность. Для этого используют микроскопию при увеличении 200–400× и, в зависимости от концентрации, накрывают покровным стеклом ранее исследованную каплю или каплю разбавленной спермы (для разбавления используют подогретый раствор цитрата натрия). Индивидуальную подвижность оценивают как «очень хорошую», если она превышает 70%, как «хорошую» — при 50–69%, как «удовлетворительную» — при 30–49% и как «плохую» — если она составляет менее 30%.8
Согласно действующим стандартам Общества териогенологии (SFT), подвижность сперматозоидов у быков должна оцениваться как минимум «удовлетворительно» по результатам оценки индивидуальной или общей подвижности.9Хотя такой порог может показаться низким, это лишь минимальное требование. Кроме того, положительная корреляция между подвижностью сперматозоидов и оплодотворяющей способностью, наблюдаемая при искусственном осеменении, по-видимому, отсутствует при естественной случке быков.10
Оценка морфологии сперматозоидов
Точная оценка морфологии сперматозоидов начинается с приготовления окрашенного препарата диагностического качества и использования светлопольного микроскопа как минимум с иммерсионным объективом 100× (увеличение 1000×) либо высококачественного фазово-контрастного микроскопа. Кроме того, необходимо тщательно исследовать не менее 100 сперматозоидов. Хотя, строго говоря, тот, кто
