Воспроизводство крупного рогатого скота

Глава 56

Инфекционные агенты: Трихомониаз

Mike Thompson

Ветеринарная клиника Willow Bend, Холли-Спрингс, Миссисипи, США

Вступление

Трихомониаз коварное венерическое заболевание крупного рогатого скота, вызванное простейшим Tritrichomonas foetus. В течение прошлого столетия репродуктивная недостаточность изза T. fetus была признана во всем мире. Быки обычно являются бессимптомными носителями, в то время как самки несут основной груз заболевания, которое чаще всего проявляется ранними эмбриональными потерями. В то время как самки обладают достаточной способностью избавиться от инфекции, быки могут стать хроническими бессимптомными носителями, и эта вероятность возрастает с увеличением возраста быка. Тестирование на T. fetus проблематично как у самцов, так и у самок, так как необходимо проводить множество последовательных тестов для достижения удовлетворительной чувствительности и специфичности. В Соединенных Штатах не существует узаконенного эффективного лечения трихомониаза, что приводит к установлению правил, требующих удаления положительных быков из стада. Вакцина существует, но ее эффективность была поставлена под сомнение, особенно при использовании на более старых быках. Биобезопасность играет важную роль в предотвращении низкого уровня воспроизводства в скотоводстве. Для обозначения инфекций T. fetus у крупного рогатого скота используются термины «трихомониаз» и «трихомоноз».

Характеристика организма

Tritrichomonas foetus представляет собой подвижный жгутиковый простейший организм размером 10–15 × 5–10 мкм. Трофозоитная форма имеет три передних и один задний жгутики и одну волнообразную мембрану вдоль длинной оси организма.^1,2 Форма псевдоцисты обычно возникает, когда трофозоиты подвергаются стрессовым условиям. Во время трансформации из трофозоита в псевдоцисту организм теряет свою каплевидную форму, становится более округлым и утрачивает жгутики. В псевдоцисте внутренние клеточные структуры продолжают реплицироваться, что приводит к образованию многоядерного организма.^1,2 Этот организм является микроаэрофильным, лучше всего выживающим в зонах с низким содержанием кислорода. При наблюдении во влажных нефиксированных препаратах Т. fetus совершают вращательные толчкообразные движения.¹ Хотя внешний вид и движения организма в питательных средах довольно характерны, диагносты должны знать, что в культурах препуциальных соскобов или цервикальной слизи могут присутствовать трихомонады, отличные от T. fetus. Эти микроорганизмы могут быть причиной ложно-положительных результатов исследований^1–7 (Рисунок 56.1).

Клинические признаки

Клинические признаки трихомониаза у самцов встречаются редко или вообще отсутствуют, хотя при T. fetus наблюдался умеренный баланопостит. У самок инфекция характеризуется ранней эмбриональной смертностью, посткоитальной пиометрой и иногда абортом.^1,3,6,8 Трихомониаз следует подозревать в стадах с низким общим индексом стельности и широким распределением сроков стельности. В анамнезе использование ранее случавшихся быков с неизвестным статусом по трихомониазу, наряду с признаками ранней эмбриональной гибели и посткоитальной пиометры, должны вызывать подозрения на присутствие T. foetus в стадах с плохим уровнем воспроизводства.^1,4,8

После заражения быки могут стать бессимптомными носителями и не способны устранить инфекцию. Уже давно существует догмат о том, что у более старых быков гистологическая структура полового члена и препитуального эпителия отличаются от более молодых быков, при этом крипты и складки с возрастом увеличиваются и становятся глубже.¹ Хотя с этим и связывали то, что возрастные быки чаще становятся хроническими носителями T. fetus, Strickland и соавт.⁹ не выявили статистических различий в гистологических образцах от более молодых быков по сравнению с таковыми от более старых быков в отношении эпителия препуция и полового члена, и количества и площади эпителиальных складок. Зараженные коровы и телки формируют иммунный ответ и зачастую способны уничтожить микроорганизм через 6–12 недель после заражения. Самки реже становятся носителями, сохраняя это состояние на протяжении всей беременности и в течение следующего случного сезона или дольше.^1,3,4,6,8

Диагностика

Диагностические тесты, обычно используемые для выявления T. fetus, включают культивирование с идентификацией под микроскопом и полимеразную цепную реакцию (ПЦР).^1,3 Организм иногда можно обнаружить с помощью микроскопического исследования свежих (без питательной среды) образцов, но этому методу не хватает чувствительности. Как при культивировании, так и при проведении ПЦР образец инкубируют в среде Diamond или, чаще, в коммерчески доступном двухкамерном пакете, заполненном средой (InPouch ™).⁴

Для культивирования образец инкубируют до 6 дней приблизительно при 36°С. Образец ежедневно проверяют под световым микроскопом на наличие T. foetus.⁵ Определение T. fetus в культуре основано на морфологических и двигательных характеристиках организма.¹ Чувствительность теста может быть определена как доля фактически положительных животных, которые диагностированы правильно. Специфичность теста может быть определена как доля фактически отрицательных животных, которые диагностированы правильно. На чувствительность и специфичность культивирования и ПЦР при T. fetus могут оказывать влияние факторы, возникающие на каждом уровне процесса тестирования, включая сбор образцов, их обработку и доставку, а также лабораторные процедуры и тип ПЦР-теста, используемого в лаборатории.¹⁰ Сообщается, что чувствительность для отдельной культуры варьирует от 84 до 96% в экспериментальных условиях, но может быть снижена до 65% в субоптимальных полевых условиях.⁷ Специфичность культуры может ухудшаться из-за присутствия морфологически сходных трихомонад.^1,3,5–7,10 ПЦР позволяет обнаруживать малые количества генетического материала организма-мишени путем амплификации специфических фрагментов ДНК, уникальных для микроорганизма.10 ПЦР может также использоваться для подтверждения идентичности микроорганизмов после культивирования, чтобы избежать ложноположительных результатов из-за морфологически сходных трихомонад.1,3,4,7,10,11 Поскольку с помощью ПЦР можно обнаруживать меньшее количество T. fetus, чем при культивировании, образцы могут обрабатываться иначе, чем для культивирования.^10,11 Эти варианты включают, но не ограничиваются, немедленное тестирование образца из культуральной среды с помощью ПЦР, инкубацию в течение 1-2 дней в культуральной среде с последующей ПЦР, инкубацию в течение 1-2 дней в культуральной среде и затем замораживание образца перед отправкой, и свежий образец для ПЦР-тестирования без использования какого-либо типа питательной среды.^5,7,10,12 Поскольку чувствительность и специфичность этих разных методов варьируют, перед отправкой следует проконсультироваться с принимающей лабораторией, чтобы выполнить конкретные требования этой лаборатории. Показано, что чувствительность и специфичность однократного теста ПЦР выше, чем однократного посева, хотя оба параметра могут быть улучшены с помощью серийного тестирования, а также комбинирования тестов ПЦР и культивирования на одном образце.5

Сравнение различных схем тестирования с использованием различных комбинаций ПЦР и культивирования, а также различных полевых условий и способов обработки образцов показывает, что достигнут широкий диапазон чувствительности и специфичности.^3,5,7,12

Как и в большинстве схем тестирования, повышение чувствительности может оказать негативное влияние на специфичность. Хотя все типы ПЦР-тестов обладают специфичностью, превышающей 90%, ветеринары и производители должны знать, что могут иметь место ложные срабатывания, хотя было показано, что эта вероятность уменьшается при серийном и/или комбинированном тестировании.^5,7 Из-за вероятности ложных срабатываний ветеринарному, лабораторному и управляющему персоналу следует проявлять осмотрительность в отношении животных с положительным тестом, особенно до тех пор, пока результаты теста не будут подтверждены.

Об обнаружении Трихомониаз сообщается государственным органам по контролю за здоровьем животных, и в нескольких штатах у прежде крывших быков должны быть отобраны препуциальные образцы, протестированные либо однократно ПЦР, либо трехкратным еженедельным культивированием. Эти правила часто меняются и отличаются между штатами. Данные полевых исследований, в которых использовались общие методы тестирования, а также экспериментальные эпидемиологические модели, не подтверждают практику приравнивания одного теста ПЦР к трехкратному еженедельному культивированию препуциальных проб.^5,7 Cobo с соавт.⁷ показали чувствительность однократного посева на уровне 67,8%, а чувствительность однократного анализа ПЦР - 65,9%. Объединение обоих тестов на одном образце увеличило чувствительность до 78,3%, что эквивалентно двум тестам ПЦР, взятым с интервалом в 1 неделю. Ondrak и соавт.⁵ сообщили, что ПЦР в реальном времени была менее чувствительной и специфичной, чем гель-ПЦР (gPCR) при сравнении их результатов с образцами, взятыми у быков, которые были либо положительными, либо отрицательными при трехкратном культивировании с интервалом в 1 неделю. Монтилья и др.¹² продемонстрировали отличную чувствительность при использовании одного gPCR, когда образцы инкубировали в течение 24 часов, а затем замораживали для отправки. Неопубликованные экспериментальные эпидемиологические данные, сформулированные с помощью моделей, разработанных Сандерсоном, показывают значительное снижение чувствительности и специфичности при сравнении однократного анализа ПЦР с трехкратным еженедельным культивированием (из личного сообщения М. Сандерсона). Из-за сложностей, связанных с цитируемыми исследованиями, схемы тестирования должны быть адаптированы к распространенности трихомониаза в стаде и прилегающих районах, возрасту и анамнезу тестируемого быка, индивидуальным государственным нормативам и используемой лаборатории.

Производители должны быть осведомлены об ограничениях этих протоколов и о том, как можно улучшить чувствительность и специфичность, используя более интенсивные протоколы, чем те, что установлены правилами.^5,7 Поскольку нет протокола исследований, подходящего для всех ситуаций, эти протоколы должны основываться на соответствующем риске, с повышением уровня тестирования в областях с более высокой частотой трихомониаза, а также на отдельных быках в группе высокого риска, таких как более старые быки, о которых известно, что они спаривались ранее.^8,11 Практика 6-кратного еженедельного культивирования исторически считалась золотым стандартом в индустрии искусственного осеменения.⁷ Должно применяться любое количество еженедельных посевов, ПЦР-анализов или их комбинаций, чтобы убедиться в отсутствии уровня риска тестируемого быка, независимо от минимальных требований к тестированию для соответствия государственным нормам.

Правильный отбор проб у быка ветеринаром требует обучения, внимания к деталям и базовых знаний о патогене и его поведении в транспортных / культуральных средах.

Материалы, необходимые для взятия проб, включают в себя инфузионную пипетку, шприц на 12 мл, маркерную ручку, емкость для хранения трих-пакетиков в вертикальном положении после инокуляции (прививки, помещения в них зараженного образца) , ножницы, дезинфицирующее средство, бумажные полотенца, перчатки для осмотра, шприц на 60 мл, физиологический раствор, InPouch™, вторичные транспортные контейнеры и изолированный транспортный бокс^5,7,13 (рис. 56.2).

Быки должны быть освобождены от случки за 1 неделю до тестирования. Сбор образцов начинается с подготовки необходимых материалов и удержания быка таким образом, чтобы образец был взят правильно и безопасно. Задняя нога, ближайшая к ветврачу, при необходимости может быть привязана для безопасности. Ветеринар надевает чистую пару латексных перчаток, чтобы уменьшить вероятность перекрестного заражения между быками. Волосы возле препуциального отверстия подстригают, а само отверстие высушивают бумажным полотенцем. Крайняя плоть теперь может быть промыта небольшим количеством физиологического раствора у быков, у которых она чрезмерно грязная или сухая. Инфузионную пипетку прикрепляют к стерильному шприцу объемом 12 мл. Пипетку желательно защитить пластиковым чехлом. Затем пипетку продвигают в канал препуциального мешка приблизительно до уровня свода, и крайняя часть достаточно агрессивно соскребается с одновременным приложением отрицательного давления в присоединенном шприце (Рисунок 56.3). Соскоб должен быть достаточно агрессивным, чтобы захватить не менее 1,5–2 см смегмы внутрь пипетки, но не настолько агрессивным, чтобы образец был загрязнен кровью. Затем образец инокулируется в правильно идентифицированный InPouch™ (автономное устройство со средой для выделения и обнаружения патогена) .

Пипетку помещают в среду в верхней камере InPouch™, аспирируя и удаляя жидкость несколько раз, чтобы эффективно смыть образец из пипетки в среду. Пакет затем складывают несколько раз в соответствии с рекомендациями производителя для экспрессии жидкости и образца из верхнего в нижний отсек пакета. Затем пакет закрывают проволочными стяжками и помещают в вертикальное положение. Теперь он должен быть защищен от прямых солнечных лучей и храниться при температуре от 20 до 37°C до тех пор, пока он не попадет в лабораторию с собственноручной доставкой или посредством службы ночной доставки. Поскольку требования к перевозке могут варьироваться в разных лабораториях, необходимо проконсультироваться с лабораториейполучателем до начала тестирования.^4,5,7,10,13

Для доставки пакеты должны быть помещены во вторичный транспортный контейнер, который трудно помять, а он помещен в изолированный бокс (коробку) , который должным образом маркирован для биологических продуктов, подлежащих отправке в течение ночи.^7,13 Эти образцы должны быть отправлены в ветеринарную диагностическую лабораторию, которая придерживается руководящих принципов, соответствующих или превышающих те, которые установлены Американской ассоциацией ветеринарных лабораторных диагностов. Эти лаборатории нацелены использовать лучшие доступные методы тестирования и по мере необходимости обращаются к услугам сторонних лабораторий для подтверждения результатов. Недавно появились новые устройства для отбора проб у быков. Устройство, известное как бычий рашпиль или Tricamper™, продаваемый в Австралии, и устройство, известное как Trichit™, которое продается в Соединенных Штатах, вводятся в препуциальную полость, как и пипетка, и используются для соскоба тканей. Эти устройства затем промывают в питательную среду для извлечения образца. Эти устройства могут обеспечить лучший отбор проб с меньшим загрязнением кровью. Сбор образцов слизи из влагалища у самок для культивирования или ПЦР также можно осуществить с помощью пипетки или любого из этих устройств¹⁴ (рис. 56.4).