Воспроизводство крупного рогатого скота

Глава 79

Оценка полученных in vivo эмбрионов крупного рогатого скота

Marianna M. Jahnke¹ , James K. West² и Curtis R. Youngs³

• 1 Кафедра ветеринарной диагностики и продуктивного животноводства, Колледж ветеринарной медицины, Университет штата Айова, Эймс, Айова, США

• 2 Директор службы переноса эмбрионов, Университет штата Айова, Эймс, Айова, США

3 Кафедра зоотехнии, Университет штата Айова, Эймс, Айова, США

Введение

Морфологическую оценку качества эмбрионов проводят по трём основным причинам. Первая — чтобы отличить эмбрионы от неоплодотворённых яйцеклеток. Тщательная оценка полученных эмбрионов и яйцеклеток необходима, чтобы не выбросить жизнеспособные эмбрионы и, наоборот, не перенести или не подвергнуть криоконсервации неоплодотворённые яйцеклетки. Вторая причина проведения морфологической оценки эмбрионов, полученных от донора, — определить, соответствует ли стадия их развития ожидаемой с учётом числа дней после течки, на которые их получили. Среди эмбрионов, полученных от одной самки-донора, часто наблюдается значительная вариабельность стадий развития; эту вариабельность следует учитывать при выборе подходящей самки-реципиента. Третья причина оценки качества эмбрионов — предоставить специалистам достаточно информации для принятия решения о переносе или криоконсервации полученных эмбрионов. Эмбрионы более низкого качества, перенос которых в свежем виде может привести к наступлению стельности, обычно не выдерживают криоконсервации.

Несмотря на важность этой темы, освоить оценку эмбрионов как часть процесса их переноса трудно, особенно при самостоятельном обучении. Хотя в этой главе приведено множество полезных фотографий эмбрионов и неоплодотворённых яйцеклеток, начинающим специалистам было бы полезно пройти интенсивное обучение с многократной практикой морфологической оценки эмбрионов под руководством опытного наставника по переносу эмбрионов. Надлежащая подготовка, соответствующее оборудование и большой практический опыт — три основных фактора, определяющих квалификацию специалиста в оценке эмбрионов.

История оценки эмбрионов крупного рогатого скота

Самые ранние стадии эмбрионального развития крупного рогатого скота (яйцеклетка и 2-клеточный эмбрион) впервые были описаны в 1931 г. Hartman и соавт. .¹ В последующее десятилетие ещё две исследовательские

группы^2,3 описали и проиллюстрировали различные стадии эмбрионального развития крупного рогатого скота. Эти первые описания эмбрионального развития легли в основу метода морфологической оценки эмбрионов, который впоследствии развился и получил широкое распространение в коммерческой практике переноса эмбрионов крупного рогатого скота.⁴

Метод морфологической оценки эмбрионов основан на способности человека визуально различать тонкие особенности полученных эмбрионов. В первые годы применения этот метод критиковали за чрезмерную субъективность, непоследовательность результатов и подверженность ошибкам. Поэтому изучали несколько альтернативных методов оценки качества эмбрионов, которые потенциально могли быть менее субъективными и давать более стабильные результаты, чем морфологическая оценка. Среди изучавшихся показателей и методов были способность эмбриона продолжать развитие при культивировании in vitro,^5,6 тест с исключением красителя,⁷ измерение метаболической активности эмбриона,⁶ поглощение глюкозы,⁸ окрашивание для выявления живых и мёртвых клеток,⁹ компьютерный анализ изображений,¹⁰ прижизненное окрашивание диацетатом флуоресцеина,^11,12 окрашивание DAPI (4′,6′-диамино-2-фенилиндолом) для выявления мёртвых клеток,¹³ и культивирование in vivo в яйцеводах кроликов.¹⁴

Совершенствование метода морфологической оценки эмбрионов

Несмотря на многочисленные попытки разработать более точный метод оценки жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота, позволяющий надёжнее прогнозировать их дальнейшее развитие, методов, признанных лучшими или более точными, чем морфологическая оценка эмбрионов, пока не создано. В клинических условиях этот метод предпочитают для оценки жизнеспособности эмбрионов, поскольку он относительно прост и позволяет достаточно быстро оценить эмбрионы крупного рогатого скота.

После ранней публикации об оценке эмбрионов крупного рогатого скота, вышедшей в 1976 г. за авторством Shea и соавт. ,⁴ в течение следующих 7 лет были опубликованы ещё три основополагающие работы по оценке эмбрионов.^15–17 Эти две группы практикующих специалистов и учёных описали критерии, которые по большей части до сих пор используются в качестве общих

руководство по оценке эмбрионов и прогнозированию вероятности наступления беременности. В последней из этих работ¹⁷ описаны многочисленные параметры, обычно используемые для оценки эмбрионов, включая стадию эмбрионального развития и особенности строения: размер и форму эмбриона, наличие вышедших за его пределы или дегенерировавших клеток, окраску, количество и плотность расположения клеток (также называемых бластомерами), из которых состоит эмбрион на ранней стадии развития, целостность блестящей оболочки, а также наличие или отсутствие вакуолей в цитоплазме бластомеров эмбриона.

История системы оценки качества и классификации эмбрионов IETS

Международное общество трансплантации эмбрионов (IETS) — международная организация, основанная в 1974 году в Денвере, штат Колорадо, США. Её создала группа североамериканских практикующих специалистов и учёных, осознавших необходимость обмена научными открытиями. По мере роста мировой отрасли коммерческой трансплантации эмбрионов возникла острая необходимость в стандартизированной номенклатуре, чтобы покупатели и продавцы эмбрионов точно знали стадию развития и качество предлагаемых эмбрионов.

В своём руководстве IETS опубликовало¹⁸ рекомендованную систему двухзначных кодов для единообразного и систематического описания эмбрионов и их характеристик. После морфологической оценки эмбриону присваивают два числа, разделённые дефисом: они обозначают стадию эмбрионального развития и категорию качества эмбриона. Стандартизированные коды стадий эмбрионального развития варьируются от 1 (неоплодотворённая яйцеклетка) до 9 (расширяющаяся бластоциста, вышедшая из оболочки). Стандартизированный код качества эмбриона, определяемого по его морфологическим признакам, также является числовым и варьируется от 1 (отличное/хорошее качество) до 4 (погибший/дегенерирующий эмбрион). Использование системы оценки качества и классификации эмбрионов IETS обязательно при международной торговле эмбрионами; поэтому большинство практикующих специалистов применяют её и в повседневной работе. Более подробное описание этой системы приведено далее в главе.

Важность хорошего микроскопа

Прежде чем перейти к конкретной методике морфологической оценки эмбрионов, важно напомнить читателям, что для точной оценки необходимо надлежащее оборудование. Хотя многие начинающие специалисты по трансплантации эмбрионов стремятся купить недорогой микроскоп, чтобы сократить первоначальные затраты, такой выбор, скорее всего, затруднит поиск и оценку эмбрионов. При использовании микроскопа низкого качества специалисту бывает крайне трудно отличить неоплодотворённую яйцеклетку (UFO) от компактной морулы. Кроме того, такой микроскоп мешает различать категории качества эмбрионов.

В отличие от оценки спермы, для которой используют составной микроскоп, при трансплантации эмбрионов необходим стереомикроскоп. Стереомикроскопы, также называемые препаровальными микроскопами, предназначены для исследования объёмных объектов.

Эмбрионы крупного рогатого скота до имплантации, несмотря на микроскопические размеры, имеют округлую форму, подобно баскетбольному мячу, поэтому их лучше всего оценивать с помощью стереомикроскопа.

У стереомикроскопа есть несколько важных характеристик, непосредственно влияющих на то, насколько легко и точно можно оценивать эмбрионы. Одна из них — общее увеличение. Оно зависит от увеличения окуляров, объектива и трансфокатора. Например, общее увеличение стереомикроскопа с окулярами 10×, объективом 1× и трансфокатором 2× составит приблизительно 20× (10 × 1 × 2 = 20). Многие специалисты предпочитают искать эмбрионы при общем увеличении от 10× до 15×, но для эффективной оценки мелких деталей и выявления таких отклонений, как трещины в блестящей оболочке, эмбрионы следует рассматривать под стереомикроскопом с хорошим оптическим качеством и диапазоном увеличения, достигающим как минимум 50×. Следует отметить, что утверждённая IETS процедура санитарной обработки эмбрионов требует их осмотра при увеличении не менее 50 × .

Большинство специалистов по трансплантации эмбрионов предпочитают окуляры с увеличением не более 10×, чтобы сохранить достаточные поле зрения и разрешение изображения. Микроскоп с диоптрийной регулировкой хотя бы одного окуляра (если не обоих) очень полезен для компенсации различий в зрении левого и правого глаза специалиста. Регулируемая бинокулярная насадка также позволяет нескольким специалистам с разным межзрачковым расстоянием пользоваться одним стереомикроскопом.

Вторая важная характеристика стереомикроскопа для работы с эмбрионами и их оценки — рабочее расстояние (расстояние от эмбриона до объектива). Оно должно быть большим, чтобы обеспечить максимальную свободу действий при поиске эмбрионов. Предметный столик микроскопа должен быть просторным и не иметь препятствий, таких как зажимы для препаратов, кнопки питания и подобные элементы, затрудняющие перемещение чашек Петри по столику. Просторный, свободный от препятствий столик позволяет перемещать чашки Петри и работать инструментом для манипуляций с эмбрионами, не рискуя случайно опрокинуть чашку и потерять эмбрионы.

Третья важная характеристика стереомикроскопа, используемого для оценки эмбрионов, — освещение. Свет должен поступать снизу, под пластиной предметного столика, и быть ярким и равномерным по всей её площади. Пластина столика должна быть прозрачной; матовые пластины для работы с эмбрионами не подходят. Для большинства стереомикроскопов стандартным является освещение по методу светлого поля, но при поиске эмбрионов в «мутной» жидкости в поисковой чашке может помочь освещение по методу тёмного поля.

Нормальное in vivo эмбриональное развитие крупного рогатого скота

Чтобы определять, развивались ли эмбрионы, полученные от донора, с ожидаемой скоростью, специалистам необходимо хорошо понимать нормальное in vivo эмбриональное развитие крупного рогатого скота. Общий диаметр эмбриона крупного рогатого скота составляет 150–190 μm (или примерно в 15 раз больше размера белых кровяных клеток); сюда входит блестящая оболочка толщиной приблизительно 12–15 μm.¹⁷ Общий диаметр эмбриона внутри блестящей оболочки практически не меняется от стадии 1 клеток до стадии бластоцисты, поскольку бластомеры

Блестящая оболочка
Перивителлиновое пространство
Внутренняя клеточная масса
Полость бластоцеля
Клетки трофобласта

Рисунок 79.1 Схематическое изображение эмбриона крупного рогатого скота на стадии бластоцисты.

(отдельные клетки оплодотворённого эмбриона до клеточной дифференцировки на стадии бластоцисты) становятся всё меньше с каждым делением клетки.

Блестящая оболочка — это полупрозрачная оболочка, окружающая эмбрион от стадии 1 клеток до стадии расширенной бластоцисты. Она служит физическим барьером для патогенов, содержит рецепторы для сперматозоидов и препятствует проникновению дополнительных сперматозоидов в яйцеклетку. Когда эмбрион достигает стадии расширенной бластоцисты и продолжает расти, он становится настолько большим, что разрывает блестящую оболочку и «вылупляется».

В ходе нормального in vivo эмбрионального развития бластомеры проходят ряд делений дробления. После оплодотворения яйцеклетка делится и развивается в эмбрион из 2 клеток, эмбрион из 2 клеток — в эмбрион из 4 клеток, эмбрион из 4 клеток — в эмбрион из 8 клеток и так далее. Когда бластомеры напоминают гроздь винограда и отдельные бластомеры невозможно различить, эта стадия эмбрионального развития называется стадией морулы. По мере дальнейшего развития эмбрион готовится к первой дифференцировке, называемой бластуляцией. Непосредственно перед ней клетки морулы «уплотняются» и распределяются между «внутренней» и «наружной» частями эмбриона.

После бластуляции эмбрион находится на стадии бластоцисты. Бластоциста содержит две популяции дифференцированных клеток: наружное кольцо клеток трофобласта и внутреннее скопление клеток, называемое внутренней клеточной массой. Из внутренней клеточной массы (ICM) развиваются плод и большая часть слоёв плаценты, а клетки трофобласта со временем образуют её наружный слой. Ещё один отличительный признак бластоцисты — наличие полости бластоцеля. Эта заполненная жидкостью полость окружена клетками трофобласта и постепенно увеличивается, способствуя истончению блестящей оболочки перед выходом из неё эмбриона. На рисунке 79.1 показаны признаки эмбриона крупного рогатого скота на стадии бластоцисты, а на рисунке 79.2 — стадии эмбрионального развития крупного рогатого скота.

Система оценки качества и классификации эмбрионов IETS

Эмбрионы обычно получают через 6–8 дней после начала охоты. Полученные эмбрионы следует распределить по группам в зависимости от стадии развития и категории качества. В таблице 79.1 представлена действующая система оценки эмбрионов IETS; далее приводится подробное описание стадий развития. После завершения оценки специалист присваивает каждому эмбриону двухзначный код. Например, раннюю бластоцисту удовлетворительного качества

обозначают кодом 5-2. Эмбрион на стадии бластоцисты отличного или хорошего качества обозначают кодом 6-1.

Стадия эмбрионального развития

Код стадии 1: 1 клетка

Если объект, полученный на 6–8-й день, действительно состоит лишь из одной клетки, можно с уверенностью считать его неоплодотворённой яйцеклеткой (UFO). Однако начинающему специалисту бывает трудно отличить UFO от компактной морулы (код стадии 4, см. ниже). Отличить UFO от других стадий эмбрионального развития также бывает сложно, поскольку не все UFO выглядят одинаково. У многих «нормальных» UFO блестящая оболочка и оолемма (также называемая желточной оболочкой) имеют идеально сферическую форму, цитоплазма отличается относительно однородной зернистостью, а перивителлиновое пространство имеет умеренный объём. Однако у других UFO могут наблюдаться различные признаки дегенерации, в том числе фрагментация цитоплазмы, создающая ложное впечатление наличия полости бластоцеля и/или клеточного деления, а также сильное уплотнение, из-за которого UFO можно спутать с компактной морулой.

Код стадии 2: от 2 до 12 клеток

Клетки доимплантационного эмбриона до их морфологической и функциональной дифференцировки называют бластомерами. Любой эмбрион, полученный через 6–8 дней после начала охоты и содержащий 2–12 бластомеров, почти наверняка погиб или дегенерирует. В нормальных условиях такая стадия эмбрионального развития должна наблюдаться в яйцеводе (а не в матке) до 5-го дня полового цикла коровы (день 0 = начало охоты). Очевидно, что даже если эмбрион из 2–12 клеток каким-то образом остаётся жизнеспособным, его развитие сильно задержано, и его не следует использовать для трансплантации или криоконсервации.

Код стадии 3: ранняя морула

Термин «морула» происходит от латинского слова, означающего «тутовая ягода». Эмбрионы на стадии морулы состоят из группы как минимум 16 клеток. Хотя некоторые отдельные бластомеры легко различимы, другие видны лишь частично, поскольку «скрыты» за другими бластомерами. Эта стадия эмбрионального развития, как и все рассмотренные ранее стадии, плохо подходит для криоконсервации.

Код стадии 4: компактная морула

Отдельные бластомеры этого эмбриона слились, образовав плотный компактный шар клеток. На этой стадии развития эмбриона различить отдельные бластомеры невозможно. В ходе компактизации клетки распределяются между внутренней и наружной частями клеточного шара. Клетки на его поверхности образуют друг с другом плотные контакты, формируя непрерывный слой. Клетки эмбриона занимают приблизительно 60–70% пространства внутри блестящей оболочки, называемого перивителлиновым пространством. Как отмечалось ранее, эмбрион на этой стадии легко спутать с НЛО.