Воспроизводство крупного рогатого скота

Глава 63

Инфекционные агенты: Микотический аборт

Frank W. Austin

Кафедра патобиологии и популяционной медицины, Колледж ветеринарной медицины, Университет штата Миссисипи, Старквилл, штат Миссисипи, США

Вступление

Грибки - это разнообразная группа эукариот, которая включает дрожжи, плесень, грибы, ржавчинные, головневые и недавно переклассифицированные микроспоридии. Они составляют одно из пяти царств жизни (Прокариоты, Грибы, Протисты, Растения, Животные) в существующей системе классификации. Как и прочие эукариотические организмы, грибы имеют мембраносвязанные ядра, мембраносвязанные цитоплазматические органеллы и рибосомы 80S, содержащиеся в плазматической мембране. Их мембраны содержат стерины, а именно эргостерол, который определяет текучесть &����������������������' клеточных мембран и действует как пограничный липид. В грибах отсутствуют хлоропласты, которые содержатся в растениях и некоторых простейших, а клеточные стенки, в отличие от других эукариот, содержат хитин. Многие из них могут размножаться как половым (телеоморфное состояние), так и бесполым (анаморфное состояние) путем. Существует несколько действующих и признанных схем классификации для царства грибов. Недавний филогенетический анализ, основанный на рибосомальной РНК и связанных с ней генах, делит царство грибов на одно подцарство Высших грибов (Dikarya), включающее в себя отделы Аскомицеты и Базидиомикота, и пять дополнительных типов, состоящих из Хитридиомицеты, Неокаллимастигомицеты, Бластокладиомицеты, Гломеромицеты и Микроспоридии.^1,2 Таксономия, основанная на обнаружении генетических последовательностей в молекулах, оказала незначительное влияние на общеизвестные названия родо'в и видов грибов, но существенно изменила их более высокие таксономические связи. С классической медицинской точки зрения патогенные грибы также могут быть классифицированы на дерматофиты, дрожжи, диморфные грибы (имеющие две анаморфные формы), гиалиновые гифомицеты (например, Aspergillis spp.), дематициазные гифомицеты (разрозненная группа меланино-пигментированных грибов), целомицеты (анаморфные грибы, которые образуют конидии в полости, называемой пикнидия), зигомицеты (асептатные грибы) и базидиомицеты (большая группа грибов, включая пуфболы, шельфовые грибы (трутовики) , ржавчинные, головневые и грибы, которые несут споры полового происхождения на специализированных клетках, называемых базидиями).³

Кроме того, на основе морфологии и особенностей размножения грибы были исторически классифицированы на Аскомицеты (сумчатые грибы), Базидиомицеты (базидиальные грибы), Зигомицеты (конъюгационные грибы, несептированные), Дейтеромицеты (несовершенные грибы, без какого-либо известного полового состояния) и Микофиты (лишайники и симбиотические грибы).⁴ На самом базовом уровне грибы легко разделяются на две основные морфологические категории: нитчатые или настоящие грибы и дрожжи. Большинство грибов являются повсеместно распространенными в окружающей среде сапрофитами, которые питаются и перерабатывают разлагающееся органическое вещество. Они предпочитают расти в темной влажной среде. Нитевидные сапрофитные грибы, представленные гиалиновыми гифомицетами, дематиазными гифомицетами и зигомицетами, являются наиболее часто встречающимися агентами, вызывающими микотический аборт у крупного рогатого скота.

Микотические агенты, вызывающие аборт

Сообщалось, что широкое разнообразие нитчатых грибов и некоторые дрожжи вызывают аборт.⁵ Микотический аборт является спорадическим явлением. Распространенность микотических абортов варьируется от 2 до 20% в зависимости от окружающих условий, региона и времени года, и обычно поражается менее 10% стада.⁶ Наиболее распространенной причиной микотического аборта у крс является род плесневых грибов Aspergillus, ответственный приблизительно за 84% зарегистрированных случаев. Среди представителей рода A. fumigatus был указан в качестве причины в 64% из 369 случаев, когда в культуре был получен только один грибковый изолят.⁷ При смешанных грибковых инфекциях, возникающих примерно в 11% случаев, A. fumigatus был обнаружен в сочетании с другими зигомицетами в 87% исследованных случаев. Примерно в 14% из 369 исследованных случаев зигомицеты были подтверждены в качестве единственного агента, провоцирующего аборт и являются второй наиболее распространенной причиной. Зигомицеты были причиной 21% абортов при смешанных инфекциях. Дематиазные аскомицеты как отдел были связаны с 7,5% этих случаев. Дрожжи рода Candida вызывали 2,4% абортов у коров⁷ (Таблица 63.1).

Таблица 63.1 Грибы были выделены в Северной Америке из 369 образцов, в культуре которых был получен один изолят.

Источник: адаптировано из Knudtson WU, Kirkbride CA. Грибы, связанные с абортами у крупного рогатого скота в штатах северных равнин США. J Vet Diagn Invest 1992;4:181–185.

Патогенез и патология

Наиболее вероятными путями воздействия грибков, вызывающих микотический плацентит и аборт, являются дыхательные пути и желудочно-кишечный тракт.⁸ Внутриматочная инокуляция конидий Aspergillus оказалась безуспешной в экспериментальной индукции микотического аборта, и поэтому восходящее инфекцирование репродуктивного тракта кажется маловероятным.⁹ Кроме того, микотические аборты были экспериментально вызваны внутривенным введением микроконидии Aspergillus, и гематогенный путь, как полагают, является путем заражения, потому что поражения первоначально развиваются в плацентомах.⁸ Грибки могут попадать в кровообращение через альвеолярные перегородки или через желудочно-кишечные поражения, возникающие в результате пенетрации через слизистые барьеры рубца, ретикулярной или омазальной (книжка) инфекции или язвы. Как только инфекция установлена в плацентомах, она продвигается латерально в межкотиледонные пространства. Плацента становится сильно утолщенной, с кожно-подобным видом межкотиледонных промежутков. Имеет место некроз котиледонов и карункулярных тканей и утолщения на краях карункула, придающие им вогнутый или выпуклый вид. При заражении Aspergillus spp. на плаценте могут быть сухие, толстые, желтые бляшки, покрывающие межкотиледонные области и большинство котиледонов.¹⁰ (рис. 63.1).

Тяжелый плацентарный некротический васкулит с тромбозом является отличительным признаком микотического аборта. Тем не менее, плацентарные поражения с похожим внешним видом могут быть вызваны бруцеллезом и генитальным кампилобактериозом. Впоследствии может произойти инфицирование плода с вовлечением кожи, легких, мозга или печени. Смерть плода обычно связывают с плацентарной недостаточностью. Повреждения кожи обычно проявляются в виде сухих, морщинистых, выпуклых бляшек с Aspergillus spp.; напротив, плод может выглядеть влажным при заражении зигомицетами. Плод изгоняется вскоре после смерти, что чаще всего происходит между 6 и 8 месяцами стельности. Часто плацента сохраняется, и котиледоны остаются прочно прикрепленными к материнским карункулам, которые могут разрываться в районе ножки. Последнее чаще всего наблюдается при зигомикотическом аборте и впоследствии может привести к вторичным инфекциям.⁵ При отсутствии серьезных повреждений матки большинство коров выздоравливают и в дальнейшем имеют нормальную беременность.

Приблизительно в 25% случаев абортов, вызванных зигомицетом Mortierella wolfii отмечается тяжелая послеабортная пневмония.⁷ После аборта, карункулы и матка могут высвобождать большое количество инфекционных элементов, что приводит к острой грибковой эмболической пневмонии.

Коровы обычно умирают в течение 72 часов после появления клинических признаков, включающих учащенное поверхностное дыхание с принудительным выдохом.¹¹ При инфицировании плода M. wolfii обычно поражаются печень и мозг, в отличие от инфекций, вызываемых другими грибами.¹²

Диагностика

Диагностика микотического аборта может проводиться с помощью макроскопических, микроскопических, гистопатологических или культуральных (посев) методов исследования. Кроме того, для идентификации специфических грибковых агентов использовалась молекулярная детекция (выявление) генетических последовательностей.¹³ Окончательный диагноз обычно ставится на основании положительного результата нескольких из этих методов. Предварительный диагноз можно поставить, опираясь на визуальное обнаружение микроскопическими методами грибковых гиф и элементов в тканях и жидкостях плаценты или плода в сочетании с характерными грубыми поражениями. Гистопатология в сочетании с культуральными или молекулярными методами позволяет окончательно подтвердить этиологический агент, ответственный за аборт.

Образцы

Образцы для диагностики микотического аборта могут быть использованы для общего исследования, прямого микроскопического и гистопатологического исследования, грибкового культивирования и молекулярной детекции. Образцы могут включать плаценту, плод, кожу плода, легкие плода и желудочную жидкость плода. Поскольку точность диагностики микотического аборта часто зависит от подтверждения несколькими методами, как правило, требуется полный перечень представленных образцов. Образцы должны быть осторожно отобраны и для каждого из используемых методов собраны отдельно. Следует проявлять крайнюю осторожность, чтобы избежать контаминации образцов, используемых для культивирования или молекулярной детекции, что может легко привести к ложноположительным результатам.

Плацента является наиболее часто используемым и информативным препаратом в диагностике грибковых абортов. Поскольку поражения микотическим плацентитом могут быть очаговыми и не затрагивать некоторые области, для исследования следует предоставить всю плаценту. Котиледоны с тканями карункула содержат наибольшее количество организмов и считаются лучшим образцом. Плацента всегда будет вовлечена в микотический аборт; однако, плод или ткани плода не подвержены постоянному воздействию.

После аборта плод может легко контаминироваться при контакте с окружающей средой. Приблизительно в 25% случаев микотических абортов кожа плода инфицирована, а поражения представлены в виде ограниченных, слегка приподнятых, кожистых, сероватожелтых бляшек. Эти поражения могут объединяться в более крупные образования, расположенные вдоль спины, верхней части головы и основания хвоста. Хотя после аборта амниотическая жидкость обычно недоступна, она будет содержать грибковые элементы, которые при повреждении кожи будут транспортироваться в другие части плода и ткани, которые не так легко контаминируются.^10,14

Желудочная жидкость - широко используемый образец для культурального исследования и молекулярной детекции, в изгнания плода и загрязнения его поверхности. Желудочная жидкость также может быть использована в качестве превосходного образца для прямой микроскопии. Также, воздействию околоплодных вод подвергаются легкие плода, которые часто используют в качестве образца в случае загрязненной поверхности плода при использовании диагностических методов амплификации (процесс образования дополнительных копий участков хромосомной ДНК) .

Микроскопическое и гистопатологическое исследование

Прямое микроскопическое исследование плаценты, кожи плода и сычужной жидкости после их расщепления в 10–15% растворе КОН (едкий калий, щелочь) может выявить грибковые гифы. Расщепление дебриса хозяина зависит от времени и температуры и может быть ускорено с помощью слабого тепла. Прямая визуализация грибковых элементов может быть улучшена путем включения белого калькофлюора в 10%-ный раствор КОН, который специфически связывает целлюлозу и хитин клеточной стенки гриба. Белый калькофлюор (или Uvitex B, Blankophor) флуоресцирует сине-белым или яблочно-зеленым при воздействии ультрафиолетового света.^15–17 Кроме того, в раствор KOH можно добавить перманентные синие чернила Parker (10%), чтобы придать контраст и улучшить визуализацию гиалиновых гифальных элементов. Краситель лактофенол хлопковый синий может использоваться как простое положительное окрашивание образцов желудочной жидкости, для которых не обязательна щелочная обработка.

Микроскопическая морфология и характеристики грибов могут помочь в идентификации и подтверждении культурального изолята. Гифы зигомицетов относительно широкие (5–20 мкм), тонкостенные и ценоцитные (несептированные).¹⁸ На почкующиеся дрожжи с узкими основаниями и широкими псевдогифами, имеющими сжатые перегородки, могут указывать патогенные виды Candida.¹⁹ Дематиазные грибки, вызывающие аборты, имеют внутриклеточный пигмент коричневого или черного цвета (меланин), который хорошо виден. Виды Aspergillus имеют относительно узкие (2–6 мкм) гифы и частые перегородки, охватывающие параллельные стенки.¹⁰ Важно отметить, что идентификация на уровне видов с помощью прямых микроскопических методов невозможна, но эти методы можно оперативно использовать для подтверждения предполагаемого диагноза микотического аборта, выявления группы ответственных за аборт грибов и исключения других причин аборта.

Если весь плод не представлен в лабораторию, то следует отобрать подходящие области и участки плаценты, кожи и легких плода в 10% буферный нейтральный формалин для гистопатологии. В рутинных гистопатологических срезах, окрашенных гематоксилинэозином, гиалиновые грибковые элементы плохо визуализируются. Поэтому следует запросить специальное окрашивание предметных стекол Шифф-периоидной кислотой или метенаминовым серебром по Гомори, если есть подозрение на микотический аборт.