Воспроизводство крупного рогатого скота

Глава 75

Суперовуляция у коров

Reuben J. Mapletoft¹ и Gabriel A. Bó²

1 Кафедра клинических наук о крупных животных, Западный колледж ветеринарной медицины, Университет Саскачевана, Саскатун, Саскачеван, Канада

2 Институт репродукции животных Кордовы (IRAC), дорога Хенераль-Пас — местность Посо-дель-Тигре — станция

• Хенераль-Пас, почтовый индекс 5145, Кордова, Аргентина

Вступление

Целью индукции суперовуляции у крупного рогатого скота является максимальное увеличение количества оплодотворенных и трансферабельных (пригодных к пересадке) эмбрионов с высокой вероятностью наступления стельности.¹ Однако, в обзорах коммерческих отчетов о переносе эмбрионов сообщалось о широком диапазоне суперовуляторных реакций и количества полученных эмбрионов. В 2048 донорских сборах (вымываний) от мясного скота было зарегистрировано в среднем 11,5 яйцеклеток/эмбрионов с 6,2 трансферабельными эмбрионами.² Вариабельность была большой, как в плане суперовуляторной реакции, так и по качеству эмбрионов; 24% сборов не дали жизнеспособных эмбрионов, 64% дали трансферабельных эмбрионов меньше среднего, а 30% дали 70% эмбрионов. При извлечении эмбрионов от 987 дойных коров было получено немного меньше яйцеклеток/ эмбрионов, но разброс был аналогичным.³ Высокая степень непредсказуемости суперовуляторной реакции создает проблемы, которые влияют как на эффективность, так и на прибыльность программ эмбриотрансфера.⁴

Вариабельность ответа яичников на стимуляцию была связана с различиями в суперстимулирующих методах, таких как подготовка гонадотропинов, групповая и общая доза гонадотропинов, продолжительность и время обработки, а также использование дополнительных гормонов. Дополнительные факторы, которые могут быть более важными, присущи животному и окружающей его среде. Они могут включать пищевой статус, историю воспроизводства, возраст, время года, породу, влияние повторной гиперстимуляции и статус яичников на момент обработки. Хотя в понимании репродуктивной физиологии крупного рогатого скота был достигнут значительный прогресс, факторы, свойственные животному-донору, изучены лишь частично.

Гонадотропины и суперовуляция

Факторы, влияющие на суперовуляторный ответ после введения экзогенных гонадотропинов, включают источник получения гормонов, партию и биологическую активность.⁵ Для индукции суперовуляции у коровы использовались три различных типа препаратов гонадотропина: гонадотропины, полученные от свиньи, гипофиза домашних животных; лошадиный хорионический гонадотропин (eCG); человеческий менопаузальный гонадотропин или любой другой.^5,6

Менопаузальный гонадотропин человека не дает никаких преимуществ при использовании у крупного рогатого скота⁷ и не применяется в коммерческих целях; поэтому дальше обсуждаться не будет.

Экстракты гипофиза содержат фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). По оценкам, биологический период полувыведения ФСГ у коровы составляет 5 часов или меньше,⁸ поэтому его необходимо вводить два раза в день, чтобы успешно вызвать суперовуляцию.^9,10 Обычная схема обработки - это внутримышечное введение ФСГ два раза в день в течение 4 или 5 дней с общей дозой 28-50 мг (Armor) неочищенного экстракта гипофиза или 260-400 мг NIH-FSH-PI - частично очищенного экстракта гипофиза (Folltropin®-V, Bioniche Animal Health Inc., Бельвиль, Онтарио, Канада). Через 48 или 72 часа после начала обработки вводится простагландин PGF2α для индукции лютеолиза. Эструс наступает через 36–48 часов, а овуляция - на 24–36 часов позже.^11,12

Лошадиный хорионический гонадотропин (eCG) представляет собой сложный гликопротеин, обладающий активностью как ФСГ, так и лютеинизирующего гормона (ЛГ).¹³ Было показано, что его период полураспада составляет 40 часов у коровы и сохраняется в кровотоке крупного рогатого скота до 10 дней; таким образом, его обычно вводят однократно внутримышечно спустя 48 часов после инъекции PGF2α.¹⁴ Продолжительный период полураспада eCG вызывает длительную непрерывную стимуляцию яичников, ановуляцию фолликулов, нарушение эндокринных профилей и снижение качества эмбрионов.^15-18 Эти проблемы в значительной степени были преодолены с помощью внутривенной инъекции антител к eCG во время первого осеменения, через 12–18 часов после начала охоты.^14,19 Рекомендуемые дозы eCG варьируются от 1500 до 3000 МЕ, из которых при внутримышечной инъекции обычно выбирают 2500 МЕ.

Monniaux и др.¹⁰ обработали группы коров либо 2500 МЕ eCG, либо 50 мг (Armor) гипофизарного ФСГ и увидели, что частота овуляции и процент коров с более чем тремя трансферабельными эмбрионами были немного выше в группе, обработанной ФСГ, чем в группе с eCG. Хотя эти результаты согласуются с результатами Elsden и соавт,²⁰ другие исследователи не обнаружили различий между экстрактами гипофиза, содержащими ФСГ и eCG.^21,22

Исследования эндокринного статуса показали, что животные, получавшие eCG, чаще имели аномальные профили ЛГ и прогестерона,^15,23 , что было связано со снижением как процента овуляций, так и оплодотворяемости²⁴ по сравнению с коровами, получавшими ФСГ.

Хотя для фолликулогенеза у млекопитающих требуются как ФСГ, так и ЛГ, содержание ФСГ и ЛГ в неочищенных препаратах гонадотропина сильно разнится.⁵ Анализы радиорецепторов и биотесты in vitro выявили вариабельность как активности ФСГ, так и ЛГ в eCG не только среди беременных кобыл, но и у одной и той же кобылы в разные периоды беременности.¹³ Было изучено влияние соотношения ФСГ / ЛГ в eCG на суперовуляторные реакции, и была обнаружена положительная корреляция между соотношением активности ФСГ / ЛГ и суперовуляторной реакцией. Более низкие уровни активности ФСГ / ЛГ снижали овуляторный ответ у неполовозрелых крыс, а добавление ЛГ к eCG уменьшало суперовуляторный ответ у коров.^5,13

Сообщалось, что очищенные экстракты гипофиза с низким содержанием ЛГ улучшают суперовуляторную реакцию у крупного рогатого скота. Chupin и др.²⁵ сверхстимулировали три группы молочных коров равным количеством очищенного свиного (p) ФСГ - 450 мкг и различными количествами ЛГ, и показали, что средний коэффициент овуляций, общее количество эмбрионов и количество трансферабельных эмбрионов увеличивались с уменьшением дозы ЛГ. Было высказано предположение, что высокие уровни ЛГ во время суперстимуляции вызывают преждевременную активацию ооцита.¹⁶ Ряд экспериментов с экстрактом гипофиза с пониженным содержанием ЛГ²⁶ в нескольких различных дозах, в пределах от 100 до 900 мг NIH-FSH-PI, не выявили никаких доказательств пагубного влияния дозы на качество эмбриона.^6,27 С другой стороны, удвоение дозы сырых экстрактов гипофиза, содержащих как ФСГ, так и ЛГ, привело к значительному снижению частоты оплодотворения и процента пригодных к пересадке эмбрионов.⁶ В совокупности данные подтверждают гипотезу о том, что пагубное воздействие высоких доз гонадотропинов гипофиза на качество яйцеклеток / эмбрионов связано с избытком ЛГ.

Хотя обычно считается, что для успешной суперовуляции требуется некоторое количество ЛГ, уровень эндогенного ЛГ может быть достаточным. Looney и др.²⁸ сообщили, что рекомбинантно полученный бычий (b) ФСГ вызывал высокие суперовуляторные реакции без добавления экзогенного ЛГ. Эти данные предполагают, что ЛГ не нужен в суперстимулирующих препаратах и что качество эмбриона может быть лучше при использовании чистого ФСГ. Очень высокая частота оплодотворения и частота переносимых эмбрионов в отсутствие экзогенного ЛГ предполагают, что введение ЛГ в протоколах суперстимуляции в любой дозе может быть вредным для качества эмбриона. Кроме того, эти результаты и более свежие данные с рекомбинантным bFSH29 указывают на то, что будущий прогресс заключается в использовании рекомбинантно-полученных гонадотропинов.

Влияние ЛГ на суперовуляторную реакцию также было продемонстрировано в эксперименте с телками кросса Брахман (Bos indicus), суперстимулированных 400 мг NIH-FSH-PI, содержащим 100%, 16% или 2% ЛГ.³⁰ Хотя более очищенные препараты в этом эксперименте вызвали более высокие суперовуляторные реакции, наблюдались очевидные сезонные закономерности; реакции с наиболее очищенными и промежуточными препаратами превосходили наименее очищенный препарат в летние месяцы, но только наиболее очищенный препарат был высокоэффективным в зимние месяцы. Эти результаты, по-видимому, противоречат выводам Page и др.³¹ , которые сообщили, что суперовуляторная реакция и качество эмбрионов у телок

голштинской породы не зависели от уровня ЛГ в прохладную погоду, но во время теплового стресса более очищенный препарат давал больше желтых тел и значительно больше оплодотворенных яйцеклеток и трансферабельных эмбрионов. Становится очевидным, что стресс - это общий фактор; породы Bos taurus, вероятно, испытывают в летнюю жару стресс, в то время как породы Bos indicus, скорее всего, испытывают стресс в зимних условиях. В любом случае более очищенные экстракты приводили к более выраженным суперовуляторным ответам в условиях стресса под влиянием окружающей среды.

Волновая динамика фолликулов и суперстимуляция

Сообщалось, что суперстимулирующий ответ выше, если лечение начато до отбора доминантного фолликула. В одном раннем исследовании рекомбинантный bФСГ, введенный телкам в 1-й день цикла (овуляция = день 0), до периода отбора доминантного фолликула волны 1, приводил к большему количеству овуляций, чем на 5-й день, после отбора.³² Последующее исследование было проведено, чтобы определить, оказывает ли экзогенный ФСГ, введенный в ожидаемое время всплеска эндогенного волнового ФСГ, положительный эффект на сверхстимулирующий ответ.³³ Поскольку ожидалось, что эндогенный выброс ФСГ достигнет пика за 1 день до появления волны,³⁴ обработку начинали за день до, непосредственно в день или через 1-2 дня после появления волны. Значительно больше фолликулов было рекрутировано (отобрано) , когда лечение было начато в день или за день до появления фолликулярной волны, и было обнаружено больше овуляций, когда лечение было начато в день появления волны, а не за день до или через 1-2 дня после ее появления. Последующее исследование показало, что суперовуляция вызывалась с равной эффективностью, когда лечение было начато как во время первой так и во время второй фолликулярной волны, и что суперстимулирующий ответ был лучше, когда лечение начиналось во время появления фолликулярной волны.³⁵

Суперстимуляция: традиционный подход

На самых ранние этапах формирования эмбриотрансфера крупного рогатого скота обработка eCG была согласована с естественной регрессией желтого тела (то есть примерно на 16-й день цикла).¹² С введением PGF2α в 1970-х годах стало возможным начинать лечение гонадотропинами в другое время на протяжении эстрального цикла, и большинство практикующих врачей начинали лечение с ФСГ в середине цикла (то есть через 8–12 дней после эструса).^36,37 Хотя первоначально этот подход был основан на случайных свидетельствах, а затем на некоторых экспериментальных данных,³⁸ теперь известно, что он включает время появления второй фолликулярной волны у коров, демонстрирующих двух- или трехволновые циклы.^39,40

Многие практикующие врачи предпочитают сокращать график дозирования ФСГ и вводить PGF2α на третий день протокола, в то время как другие предпочитают вводить PGF2α на четвертый день, а многие вовсе не обрабатывают ФСГ на следующий день после введения PGF2α. Хотя не было обнаружено различий между 4- и 5-дневными протоколами лечения, недавние эксперименты показали, что число овуляций может быть улучшено у некоторых доноров, если лечение ФСГ продлено до 6 или 7 дней.^{41, 42}

Тем не менее, большинство протоколов суперстимуляции в большинстве случаев успешно вызывают суперовуляцию.

Третьи включают в протокол прогестиновый инплант, который гарантирует, что у доноров не произойдет преждевременная охота, особенно если невозможно подтвердить наличие желтого тела до начала обработки ФСГ. Во всех случаях осеменение обычно проводится через 12 и 24 часа после начала течки.^11,37

Хотя способ суперстимуляции, начиная с середины цикла служил индустрии эмбриотрансфера на протяжении многих лет, традиционные протоколы стимуляции имеют два недостатка: 1) требование наличия обученного персонала для выявления течки как до, так и после начала лечения; и 2) необходимость иметь всех доноров в эструсе одновременно, чтобы начать суперстимулирующую терапию в наиболее подходящее время для групп коров (т. е. в середине цикла). Чтобы избежать этих проблем, были разработаны протоколы, которые облегчают суперстимуляцию после плановой индукции появления фолликулярной волны.

Синхронизация появления фолликулярной волны для суперовуляции

Эстрадиол и прогестерон

Способность выборочно вызывать появление фолликулярной волны позволяет инициировать суперстимуляцию независимо от стадии эстрального цикла и устраняет необходимость обнаружения течки или ожидания 8–12 дней для начала лечения гонадотропинами.³⁷ В 1990-х годах сообщалось об использовании прогестинов и эстрадиола для синхронного возникновения новой фолликулярной волны³⁶ , и их использование в протоколах суперстимуляции было подробно рассмотрено.^37,43 Лечение эстрадиолом вызывает подавление высвобождения ФСГ и атрезию фолликулов. Как только эстрадиол метаболизируется, скачки уровня ФСГ и новая фолликулярная волна возникает в среднем через 4 дня после лечения.^36,44 Самый распространенный протокол включает введение 5 мг эстрадиола-17β или 2,5 мг эстрадиола бензоата плюс 100 или 50 мг прогестерона путем внутримышечной инъекции во время установки интравагинального прогестинового инпланта (день 0).^37,43 Затем на 4-й день начинают внутримышечное введение ФСГ два раза в день. На 6-й день вводят PGF2α утром и вечером, а вечером удаляют прогестероновый инплант. Эструс обычно наступает на 8-й день (примерно через 48 часов после первой инъекции PGF2α), а осеменение проводится через 12 и 24 часа.

К сожалению, эстрадиол нельзя использовать во многих странах мира из-за опасений по поводу воздействия эстрогенных веществ на пищевую цепь.⁴⁵ Это ограничение ставит многих практикующих специалистов по пересадке эмбрионов перед серьезной дилеммой и создает необходимость в разработке методов лечения, не связанных с использованием эстрадиола.

Абляция (удаление) фолликула

Альтернативой использованию эстрадиола в протоколах суперстимуляции является устранение подавляющего эффекта доминантного фолликула путем аспирации всех фолликулов размером 5 мм и более под контролем УЗИ.⁴⁶ Появление фолликулярной волны происходит почти всегда через 24–36 часов, и в это время начинают обработку суперстимуляторами. Такой подход к синхронизации появления фолликулярной волны для суперстимуляции очень эффективен и приводит к ответным суперовуляторным реакциям, которые не отличаются от таковых при использовании эстрадиола.⁴⁶

Кроме того, было обнаружено, что необходимо удалить только два самых крупных фолликула, чтобы эффективно синхронизировать появление волны.⁴⁷ Протокол включает удаление двух самых крупных фолликулов на случайных стадиях эстрального цикла и введение прогестеронового импланта; обработка ФСГ начинается через 24–48 часов, а оставшаяся часть протокола такая же, как описано выше. Недостатком аспирации фолликулов под контролем УЗИ является то, что она требует ультразвукового оборудования и обученного персонала, что делает ее целесообразной только тогда, когда доноры содержатся на предприятии по производству эмбрионов; ее очень сложно применять в полевых условиях.

Гонадотропин-рилизинг-гормон

Другой альтернативой синхронизации фолликулярной волны является индукция овуляции доминантного фолликула с помощью гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ)^48,49 , за которой через 1-2 дня возникает новая волна.⁵⁰ Однако, появление новой фолликулярной волны синхронизируется только тогда, когда инъекция вызывает овуляцию, а при введении на случайных стадиях эстрального цикла ГнРГ приводит к овуляции менее чем у 60% животных.^50,51 Неудивительно, что обработка гонадолиберином перед началом суперстимуляции на случайных стадиях эстрального цикла приводила к более низким суперовуляторным ответам, чем обработка после абляции (удаления) фолликулов или инъекции эстрадиола.⁵² Совсем недавно ретроспективный анализ данных, полученных при коммерческой пересадке эмбрионов не выявил различий в количестве полученных эмбрионов между донорами, подвергнутыми сверхстимуляции через 4 дня после лечения эстрадиолом, и теми, которые были сверхстимулированы через 2 дня после лечения гонадолиберином (Randall Hinshaw, личное сообщение).^53,54 Примечательно, что в каждом из этих отчетов ГнРГ вводили через 2 дня после введения прогестеронового устройства. Более лучшие ответные реакции на стимуляцию могли быть следствием того, что прогестерон способствовал развитияю персистентного доминантного фолликула, который был более чувствителен к лечению ГнРГ.⁵⁵ Очевидно, что для подтверждения этих многообещающих результатов необходимо провести контролируемые исследования с использованием ГнРГ.

Улучшение овуляторного ответа на гонадолиберин

Большинство протоколов искусственного осеменения (ИО) с фиксированным временем, использующих ГнРГ для синхронизации появления фолликулярной волны, включают этап пресинхронизации для улучшения овуляторной реакции на первую инъекцию ГнРГ.^55,56 Другой альтернативой является синхронизация овуляции с последующей обработкой ФСГ во время появления первой фолликулярной волны.³³ Чтобы избежать необходимости определять охоту и овуляцию у доноров Nelore (Bos indicus), Nasser и др.⁵⁷ индуцировали синхронизацию овуляции с помощью протокола на основе эстрадиола, разработанного для осеменения по фиксированному времени. Затем коров обработали гонадотропинами в ожидаемое время овуляции (и появления первой фолликулярной волны). Суперовуляторный ответ не отличался от группы, одновременно подвергнутой суперстимуляции через 4 дня после лечения эстрадиолом. Однако, количество трансферабельных эмбрионов было снижено у коров, подвергнутых суперстимуляции во время первой фолликулярной волны, если это не сопровождалось использованием прогестеронового устройства. Аналогичные результаты были получены Rivera и соавторами.⁵⁸ В их исследовании коровы голштинской породы, подвергнутые суперстимуляции во время первой фолликулярной волны, также дали большее количество жизнеспособных эмбрионов после добавления прогестинового устройства.