Воспроизводство крупного рогатого скота

Таблица 74.3 Сравнение целостности акросом и уровня кальция в живых сперматозоидах быков А и С до и после контрольной обработки тапсигаргином, как после оттаивания, так и после 5-часовой инкубации с гепарином.

Значения представляют собой средние проценты от трех протестированных проб ± SEM. Различные буквы (a, b) в одном столбце представляют достоверные различия, P <0,01 - парный t-критерий Стьюдента. AR - акросома прореагировала; High Ca - % клеток с повышенным уровнем кальция; Thaps - тапсигаргин.

Таблица 74.4 Сравнение функций сперматозоидов быков B и C сразу после оттаивания на основе анализа CASA и проточной цитометрии.

Значения представляют собой средние проценты по двум тестам ± SEM. Достоверные отличия от контроля представлены *, P <0,05 - **, P <0,001 - тестом множественного сравнения Даннета (каждая проба сравнивается с контролем) .

В семени быка A после добавления тапсигаргина по-прежнему было меньше клеток с акросомной реакцией, по сравнению с быком C (10,5 ± 2,0% против 23,1 ± 0,5%; P <0,01), но также было пропорционально меньшее увеличение процента клеток с высоким содержанием кальция. Эти наблюдения предполагают, что у сперматозоидов быка А капацитация не могла происходить в среде, содержащей гепарин, о чем свидетельствует меньшее количество клеток с акросомной реакцией и высокое содержание внутриклеточного кальция в сперматозоидах. В целом, этот анализ предполагает, что эта конкретная партия спермы быка А была недостаточно зрелой, чтобы полностью завершить процесс капацитации и реализовать свой потенциал фертильности. Saacke и др.⁶¹ описали некоторые компенсируемые и некомпенсированные нарушения функции семени, связанные с субфертильностью (недостаточной фертильностью) . Компенсируемые факторы включают функциональные или молекулярные показатели, отраженные в этом тематическом исследовании низким процентом клеток, с прореагировавшими акросомами или повышенным содержанием кальция. В этом случае может быть полезно увеличить количество сперматозоидов на соломинку у быка А, чтобы компенсировать его субфертильность. Вторым исследованным случаем был взрослый бык (бык B), который показал чрезвычайно низкую фертильность в полевых условиях (FERTSOL <–2) по нескольким различным партиям спермы, выпущенным из ЦПС после стандартных QC-тестов (проверки качества) . Сначала мы провели базовые тесты CASA/проточной цитометрии для пяти разных партий и сравнили результаты со средним быком (бык C). Все изученные партии прошли бы наши ограничения по контролю качества. Удивительно, но процентные доли общей и прогрессивной подвижности у быка B существенно не различались по сравнению с быком C (таблица 74.4). С другой стороны, акросомная реакция, гибель клеток и митохондриальная активность значительно отличались в некоторых проанализированных партиях по сравнению с быком C (таблица 74.4).

Поскольку эти результаты не могли объяснить очень низкую фертильность быка B, мы провели анализ структуры хроматина сперматозоидов, как обсуждалось ранее для тех же партий, и сравнили с результатами, полученными по быку C. Процентный индекс фрагментации ДНК был примерно в два-четыре раза выше у быка B, чем у быка C (P <0,001; Таблица 74.4). Высокий процент индекса фрагментации ДНК коррелировал с пониженной фертильностью главным образом у людей.^53,62 Следовательно, очень низкая фертильность, наблюдаемая у быка B, может быть объяснена высоким уровнем денатурации ДНК, измеренным с помощью анализа структуры хроматина сперматозоидов. В отличие от первого исследования, аберрация хроматина - это не компенсируемый фактор, связанный с субфертильностью.⁶¹ Увеличение количества сперматозоидов на соломинку в этом случае не может компенсировать чрезвычайно низкую плодовитость быка B, наблюдаемую в полевых условиях.

Выводы

Многопараметрический анализ спермы, проводимый ЦПС с помощью CASA и проточной цитометрии, демонстрирует очень высокий прогностический потенциал в плане оценки качества спермы и фертильности. Поскольку фертильность зависит от множества факторов, должны проводиться общирные исследования и разработка новых маркеров для определения спермы с высокой фертильностью. Включение новых маркеров в многопараметрический подход приведет к лучшей оценке качества спермы и фертильности. Кроме того, внедрение этих инструментов в ЦПС поможет стандартизировать процедуры контроля качества, устранив субъективный аспект оценки спермы. Это позволит стандартизировать сперму, производимую в рамках одного ЦПС и нескольких ЦПС для компаний, занимающихся ИО, которые производят сперму в нескольких лабораториях.

Еще одно применение этих инструментов в индустрии искусственного интеллекта - определение параметров семени с высокой генетической ценностью. В индустрии ИИ большая часть производимой спермы происходит от нескольких животных с высокой генетической ценностью. Эти очень востребованные на рынке образцы спермы должны быть очень хорошо охарактеризованы, чтобы оптимизировать производство по количеству производимых соломинок и по качеству спермы, доступной на рынке. В целом индустрия искусственного интеллекта выиграет от внедрения CASA и проточной цитометрии в ЦПС.

Примечание редактора

Эта глава является воспроизведением работы, подготовленной авторами, которая ранее впервые была опубликована в Proceedings Association for Applied Animal Andrology Conference (2012) и Animal Reproduction, июль / сентябрь 2012 г., книга, страницы 153–165.

Ссылки

1. Verstegen J, Iguer-Ouada M, Onclin K. Компьютерные анализаторы спермы в андрологических исследованиях и ветеринарной практике. Theriogenology 2002;57:149–179.

2. Mortimer S. CASA: практические аспекты. J Androl 2000;21:515–524.

3. Kathiravan P, Kalatharan J, Karthikeya G, Rengarajan K, Kadirvel G. Объективный анализ подвижности сперматозоидов для оценки фертильности молочных быков с помощью компьютерной системы: обзор. Reprod Domest Anim 2011;46:165–172.

4. Massányi P, Chrenek P, Lukáč N и др. Сравнение различных камер для оценки параметров подвижности сперматозоидов кроликов с помощью системы CASA. Slovak J Anim Sci 2008;41:60–66.

5. Iguer-ouada M, Verstegen J. Оценка автоматизированной компьютерной системы «Hamilton Thorn» для анализа спермы собак. Theriogenology 2001;55:733–749.

6. Purdy PH, Tharp N, Stewart T, Spiller S, Blackburn H. Влияние pH и температуры разбавленной охлаждённой спермы хряков на характеристики подвижности свежих и размороженных сперматозоидов. Theriogenology 2010;74:1304–1310.

7. Contri A, Valorz C, Faustini M, Wegher L, Carluccio A. Влияние подготовки спермы на результаты оценки подвижности криоконсервированных сперматозоидов быков методом CASA. Theriogenology 2010;74:424–435.

8. Mortimer S, Swan M. Влияние частоты получения изображений на общепринятые и не зависящие от сглаживания кинематические показатели сперматозоидов человека, проходящих капацитацию. Hum Reprod 1999;14:997–1004.

9. Brito L. Различия в лабораторных процедурах оценки и исследования спермы. В кн.: Материалы 23-й технической конференции по искусственному осеменению и воспроизводству , 2010, с. 61–67.

10. Castellini C, Dal Bosco A, Ruggeri S, Collodel G. Какая частота кадров оптимальна для оценки подвижности сперматозоидов разных видов с помощью компьютерного анализа спермы? Fertil Steril 2011;96:24–27.

11. Mortimer S, Swan M. Разработка не зависящих от сглаживания кинематических показателей движения сперматозоидов человека, проходящих капацитацию. Hum Reprod 1999;14:986–996.

12. Fernández-Santos M, Martínez-Pastor F, Matias D и др. Влияние длительного хранения в охлаждённом состоянии придатков семенников благородного оленя на целостность ДНК и подвижность размороженных сперматозоидов. Anim Reprod Sci 2009;111:93–104.

13. Zinaman M, Uhler M, Vertuno E, Fisher S, Clegg E. Оценка компьютерного анализа спермы (CASA) с окрашиванием IDENT для определения концентрации сперматозоидов. J Androl 1996;17:288–292.

14. Tardif A, Farrell P, Trouern-Trend V, Simkin M, Foote R. Использование красителя Hoechst 33342 для оценки живых сперматозоидов в свежей и замороженной сперме быков методом компьютерного анализа. J Androl 1998;19:201–206.

15. Wood P, Foulkes J, Shaw R, Melrose D. Оценка спермы, фертильность и отбор быков герефордской породы для искусственного осеменения. J Reprod Fertil 1986;76:783–795.

16. Kjaestad H, Ropstad E, Berg K. Оценка сперматологических показателей, используемых для прогнозирования фертильности замороженной спермы быков. Acta Vet Scand 1993;34:299–303.

17. Correa J, Pace M, Zavos P. Взаимосвязь характеристик сперматозоидов после замораживания и оттаивания, оцениваемых при стандартном анализе спермы и функциональных тестах сперматозоидов, с фертильностью быков в программе искусственного осеменения. Theriogenology 1997;48:721–731.

18. Gillan L, Kroetsch T, Maxwell W, Evans G. Оценка характеристик сперматозоидов in vitro в связи с фертильностью быков молочных пород. Anim Reprod Sci 2008;103:201–214.

19. Kathiravan P, Kalatharan J, Edwin M, Veerapandian C. Автоматизированный компьютерный анализ подвижности сперматозоидов быков-помесей и её связи с оплодотворением in vitro ооцитов хомяка без блестящей оболочки. Anim Reprod Sci 2008;104:9–17.

20. Farrell P, Presicce G, Brockett C, Foote R. Количественная оценка характеристик сперматозоидов быков методом компьютерного анализа спермы (CASA) и их связи с фертильностью. Theriogenology 1998;49:871–879.

21. Januskauskas A, Gil J, Söderquist L и др. Влияние скорости охлаждения на подвижность сперматозоидов после оттаивания, целостность мембран, состояние капацитации и фертильность спермы быков молочных пород, используемой для искусственного осеменения в Швеции. Theriogenology 1999;52:641–658.

22. Budworth P, Amann R, Chapman P. Взаимосвязь между измеренными с помощью компьютера показателями подвижности сперматозоидов быков после замораживания и оттаивания и фертильностью. J Androl 1988;9:41–54.

23. Davis R, Katz D. Эксплуатационные стандарты для приборов CASA. J Androl 1993;14:385–394.

24. Gillan L, Evans G, Maxwell W. Проточно-цитометрическая оценка показателей сперматозоидов в связи с потенциалом фертильности. Theriogenology 2005;63:445–457.

25. Martínez-Pastor F, Mata-Campuzano M, Alvarez-Rodríguez M, Alvarez M, Anel L, de Paz P. Зонды и методы оценки сперматозоидов с помощью проточной цитометрии. Reprod Domest Anim 2010;45(доп. 2):67–78.

26. Hossain M, Johannisson A, Wallgren M, Nagy S, Siqueira A, Rodriguez-Martinez H. Проточная цитометрия для оценки целостности и функциональности сперматозоидов животных: современное состояние. Asian J Androl 2011;13:406–419.

27. Graham J, Kunze E, Hammerstedt R. Анализ жизнеспособности сперматозоидов, целостности акросомы и функции митохондрий с помощью проточной цитометрии. Biol Reprod 1990;43:55–64.

28. Partyka A, Nizański W, Łukaszewicz E. Оценка свежей спермы птицы и спермы после замораживания и оттаивания методом проточной цитометрии. Theriogenology 2010;74:1019–1027.

29. Oldenhof H, Blässe A, Wolkers W, Bollwein H, Sieme H. Осмотические свойства субпопуляций сперматозоидов жеребца, определённые путём одновременной оценки объёма и жизнеспособности клеток. Theriogenology 2011;76:386–391.

30. Garner D, Johnson L, Yue S, Roth B, Haugland R. Оценка жизнеспособности сперматозоидов быка с помощью двойного окрашивания ДНК красителями SYBR-14 и йодидом пропидия. J Androl 1994;15:620–662.

31. Garner D, Johnson L. Оценка жизнеспособности сперматозоидов млекопитающих с использованием SYBR-14 и йодида пропидия. Biol Reprod 1995;153:276–284.

32. Marchiani S, Tamburrino L, Giuliano L и др. Сумоилирование сперматозоидов человека и его связь с качеством спермы. Int J Androl 2011;34:581–593.

33. Maxwell W, Welch G, Johnson L. Жизнеспособность и целостность мембран сперматозоидов после разбавления и сортировки методом проточной цитометрии в присутствии или отсутствие семенной плазмы. Reprod Fertil Dev 1996;8:1165–1178.

34. Nagy S, Jansen J, Topper E, Gadella B. Метод проточной цитометрии с тройным окрашиванием для оценки целостности плазматической и акросомной мембран криоконсервированных сперматозоидов быка непосредственно после оттаивания в присутствии частиц яичного желтка. Biol Reprod 2003;68:1828–1835.

1. Purvis K, Rui H, Schølberg A, Hesla S, Clausen O. Применение проточной цитометрии в исследованиях акросомы сперматозоидов человека. J Androl 1990;11:361–366.

2. Lybaert P, Danguy A, Leleux F, Meuris S, Lebrun P. Усовершенствованный метод выявления и количественной оценки акросомной реакции у сперматозоидов мыши. Histol Histopathol 2009;24:999–1007.

3. Carvalho J, Sartori R, Machado G, Mourão G, Dode M. Оценка качества криоконсервированных сперматозоидов быка после сортировки по полу методом проточной цитометрии и их использования для получения эмбрионов in vitro. Theriogenology 2010;74:1521–1530.

4. Anzar M, Kroetsch T, Boswall L. Криоконсервация спермы быков, доставленной на следующий день после отправки, и её влияние на подвижность сперматозоидов после оттаивания, целостность плазматической мембраны, мембранный потенциал митохондрий и сохранность акросом. Anim Reprod Sci 2011;126:23–31.

5. Yi Y, Zimmerman S, Manandhar G и др. Убиквитин-активирующий фермент (UBA1) необходим для капацитации сперматозоидов, акросомного экзоцитоза и проникновения сперматозоида через оболочку яйцеклетки при оплодотворении у свиней. Int J Androl 2012;35:196–210.

6. Carver-Ward J, Moran-Verbeek I, Hollanders J. Сравнительный анализ акросомной реакции сперматозоидов человека методом проточной цитометрии с использованием антитела к CD46 и лектинов. J Assist Reprod Genet 1997;14:111–119.

7. Evenson D, Darzynkiewicz Z, Melamed M. Одновременное измерение методом проточной цитометрии жизнеспособности сперматозоидов и мембранного потенциала митохондрий, связанного с подвижностью клеток. J Histochem Cytochem 1982;30:279–280.

8. Garner D, Thomas C, Joerg H, DeJarnette J, Marshall C. Флуориметрическая оценка функции митохондрий и жизнеспособности криоконсервированных сперматозоидов быка. Biol Reprod 1997;57:1401–1406.

9. Hallap T, Nagy S, Jaakma U, Johannisson A, RodriguezMartinez H. Оценка митохондриальной активности сперматозоидов после замораживания и оттаивания с помощью Mitotracker Deep Red 633. Theriogenology 2005;63:2311–2322.

10. Sousa A, Amaral A, Baptista M и др. Не все сперматозоиды одинаковы: функционирующие митохондрии отличают субпопуляцию сперматозоидов человека с более высоким потенциалом к оплодотворению. PLoS ONE 2011;6:e18112.

11. Thomas C, Garner D, DeJarnette J, Marshall C. Влияние криоконсервации на функцию органелл и жизнеспособность сперматозоидов быка по данным проточной цитометрии. Biol Reprod 1998;58: 786–793.

12. Garner D, Thomas C. Органеллоспецифичный зонд JC-1 выявляет различия мембранного потенциала митохондрий сперматозоидов быка. Mol Reprod Dev 1999;5:222–229.

13. Guthrie H, Welch G. Выявление высокого мембранного потенциала митохондрий в сперматозоидах, меченных митохондриальным зондом 5,5′,6,6′-тетрахлор--1,1′,3,3′-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианинйодидом (JC-1), методом проточной цитометрии с сортировкой клеток по флуоресценции. Methods Mol Biol 2008;477:89–97.

14. Evenson D, Jost L. Анализ структуры хроматина сперматозоидов полезен для оценки фертильности. Methods Cell Sci 2000;22:169–189.

15. Januskauskas A, Johannisson A, Rodriguez-Martinez H. Оценка качества сперматозоидов методами флуориметрии и анализа структуры хроматина в связи с фертильностью при осеменении в производственных условиях замороженно-оттаянной спермой шведских быков-производителей. Theriogenology 2001;55:947–961.

16. Januskauskas A, Johannisson A, Rodriguez-Martinez H. Незначительные изменения мембран в криоконсервированной сперме быков и их связь с жизнеспособностью сперматозоидов, структурой хроматина и фертильностью в производственных условиях. Theriogenology 2003;60:743–758.

17. Karabinus D, Evenson D, Jost L, Baer R, Kaproth M. Сравнение качества спермы молодых и взрослых голштинских быков по результатам световой микроскопии и проточной цитометрии. J Dairy Sci 1990;73:2364–2371.

18. Love C, Kenney R. Связь повышенной восприимчивости ДНК сперматозоидов к денатурации с фертильностью жеребца. Theriogenology 1998;50:955–972.

19. Evenson D, Jost L, Marshall D и др. Применение анализа структуры хроматина сперматозоидов в качестве диагностического и прогностического метода в клинике репродукции человека. Hum Reprod 1999;14:1039–1049.

20. Anzar M, He L, Buhr M, Kroetsch T, Pauls K. Апоптоз сперматозоидов в свежей и криоконсервированной сперме быков, выявленный методом проточной цитометрии, и его связь с фертильностью. Biol Reprod 2002;66:354–360.

21. Sutovsky P, Neuber E, Schatten G. Убиквитин-зависимый механизм контроля качества сперматозоидов распознаёт сперматозоиды с дефектами ДНК, что показано с помощью двойного анализа на убиквитин и TUNEL. Mol Reprod Dev 2002;61:406–413.

22. Waterhouse K, Haugan T, Kommisrud E и др. Повреждение ДНК сперматозоидов связано с фертильностью спермы молодых быков норвежской красной породы в производственных условиях. Reprod Fertil Dev 2006;18:781–788.

23. Colás C, Grasa P, Casao A и др. Изменения иммуноцитохимической локализации кальмодулина, связанные с капацитацией и акросомальным экзоцитозом сперматозоидов барана. Theriogenology 2009;71:789–800.

24. Guthrie H, Welch G, Theisen D, Woods L. Влияние хранения при пониженной температуре на внутриклеточную концентрацию кальция, образование активных форм кислорода, функцию митохондрий, подвижность и целостность плазматической мембраны сперматозоидов полосатого лаврака (Morone saxatilis). Theriogenology 2011;75:951–961.

25. Kumaresan A, Siqueira A, Hossain M, Bergqvist A. Вызванные криоконсервацией изменения фосфорилирования тирозиновых остатков белков сперматозоидов из разных фракций эякулята хряка. Cryobiology 2011;63:137–144.

26. Peña A, López-Lugilde L, Barrio M, Becerra J, Quintela L, Herradón P. Исследования внутриклеточной концентрации Ca²⁺ у сперматозоидов собак после оттаивания: влияние препарата Equex из разных источников, двух разбавителей для оттаивания и инкубации после оттаивания в условиях, способствующих капацитации. Reprod Domest Anim 2003;38:27–35.

27. Saacke R, Dalton J, Nadir R, Nebel R, Bame J. Связь характеристик спермы и времени осеменения с частотой оплодотворения и качеством эмбрионов. Anim Reprod Sci 2000;60–61:663–677.

28. Evenson D, Darzynkiewicz Z, Melamed M. Связь неоднородности хроматина сперматозоидов млекопитающих с фертильностью. Science 1980; 210:1131–1133.