Более того, в некоторых программах есть пробелы в экспорте и компиляции данных, что затрудняет анализ данных и отнимает много времени у пользователя.
Как упоминалось в разделе, посвященном анализу функции сперматозоидов с помощью проточной цитометрии, проточная цитометрия - относительно новое направление для ЦПС (Центр производства спермы) . При выборе инструмента необходимо учитывать уникальные особенности сперматозоидов. Лопастная форма головы и наличие жгутика приводят к тому, что сперматозоиды сильно отличаются друг от друга по размеру и клеточной сложности по сравнению с большинством клеток, исследованных с помощью проточной цитометрии. Действительно, большинство клеток, исследованных с помощью этой технологии, имеют круглую форму, и прохождение перед лазером приводит к четкому графику зависимости прямого и бокового рассеяния. Однако, когда сперматозоид попадает на лазер, он может быть на толстой или тонкой стороне головки. Эта уникальная особенность сперматозоидов позволяет получить диаграммы разброса разного размера и сложности. Очень важный аспект, который мы обнаружили при изучении замороженно-размороженных сперматозоидов с помощью проточной цитометрии и который обсуждался в этой главе, - это разбавитель, в котором разбавляется сперма. Как уже говорилось, для разбавления семенной жидкости используются разные типы разбавителей, и некоторые из них содержат частицы такого же размера, как и сперматозоиды. Этот аспект "загрязнения" частицами целевой популяции вызывает беспокойство при рассмотрении вопроса о покупке цитометра для многопараметрических анализов. Устройство, достаточно мощное, чтобы отличать сперматозоиды от частиц только на основании размера и сложности клеток, позволяет идентифицировать популяцию сперматозоидов без использования каких-либо флуорохромов. В результате остается доступным больше фотоумножителей для определения характеристик клеток с помощью флуорохромов. Наша лаборатория сравнила несколько проточных цитометров, и только половина из них были достаточно чувствительны, чтобы проводить различие между инородными частицами и сперматозоидами без использования какихлибо флуорохромов. Если в исследовательская лаборатории стоит цитометр, который не может отличить дебрис от сперматозоидов, то при анализе следует либо промыть клетки, чтобы удалить посторонние частицы, либо окрасить сперматозоиды флуорохромом, что оставляет меньше пробирок фотоумножителя для изучения других параметров. Не все флуорохромы подходят для разбавителей спермы, особенно для разбавителей на основе яичного желтка, которые, как известно, гасят некоторые флуоресцентные красители. Для окрашивания нуклеиновой кислоты сперматозоидов при использовании цитометра, оснащенного ультрафиолетовым или фиолетовым лазером обычно используется Hoechst 33342. Этот подход позволяет удалять частицы, выводя их наружу, что приводит к более точному анализу (рис. 74.2). К сожалению, не все системы оснащены такими лазерами для использования Hoechst 33342 в качестве красителя, "отслеживающего" клетки, но к сперме может быть добавлен краситель, проникающий в клетки, такой как SYBR-14 и тогда эта флуоресцентная популяция будет помечена для дальнейшего анализа.
Многопараметрический подход для
стандартизации и контроля качества среди ЦПС
Использование CASA и проточной цитометрии в качестве инструментов контроля качества
Субъективная оценка спермы с помощью обычной микроскопии до сих пор используется во многих ЦПС (Центр производства спермы) . Как обсуждалось ранее, этот тип оценки спермы приводит к разным решениям относительно того, принимать или отклонять партию семени во время контроля качества.
Несмотря на то, что CASA используется в некоторых ЦПС, фертильность - это многопараметрическое явление, следовательно, параметров подвижности сперматозоидов недостаточно для оценки общего потенциала фертильности образца спермы. Внедрение проточной цитометрии в ЦПС позволит лучше охарактеризовать сперматозоиды, поскольку сама по себе проточная цитометрия направлена на анализ множества параметров. Сочетание CASA и цитометрии обеспечит ЦПС мощным многопараметрическим подходом в оценке качества производимой спермы и позволит установить стандартизированные процедуры для принятия точных и универсальных решений по результатам анализа спермы. Мы оценили потенциал этих инструментов для точной оценки качества спермы, произведенной в ЦПС по всей Канаде. Процент общей и прогрессирующей подвижности и процент жизнеспособности, целостности акросом и высокой митохондриальной активности оценивали с помощью CASA и проточной цитометрии. Мы получили и повторно проанализировали 660 партий спермы с яичным разбавителем, произведенной различными ЦПС, которые ранее были проанализированы стандартным субъективным методом контроля качества, и из них 58% (n = 385) были приняты, а 42% (n = 275) были отклонены. Оценка спермы проводилась в двух разных временных точках: сразу после оттаивания и через 2 часа после воздействия теплового стресса (оценка терморезистентности) . Для каждого параметра, проанализированного с помощью CASA/проточной цитометрии в каждый момент времени были установлены пограничные значения (таблица 74.1). Партии спермы, которые не соответствовали нашему стандартному диапазону значений, были бы отклонены и выброшены. С другой стороны, если качество спермы было хорошим и соответствовало нашим пороговым значениям после оценки с использованием CASA и проточной цитометрии, то партия считалась пригодной и могла поступить на реализацию.
В таблице 74.2 показан процент из 660 партий, отклоненных после анализа с помощью CASA и проточной цитометрии. Анализ CASA показал, что 14% (94 из 660) уникальных партий не соответствовали пороговому значению сразу после размораживания по сравнению с 27% (178 из 660) уникальных партий после 2 часов инкубации. То же наблюдение можно было сделать из анализов проточной цитометрии, где 24% (156 из 660) уникальных партий были отклонены после размораживания по сравнению с 32% (214 из 660) уникальных партий после 2 часов инкубации. Этот анализ демонстрирует необходимость включения теста на терморезистентность в систему оценки качества ( QC) для повышения ее точности, в случае, когда большинство партий отбраковывается по результатам 2-часовой инкубации. Кроме того, оценка CASA привела к отбраковке 28% партий, тогда как анализ проточной цитометрии забраковал 34% (224 из 660) партий. Когда CASA и проточная цитометрия использовались в комбинации, в общей сложности 41% (268 из 660) уникальных партий были отклонены, что привело к увеличению отклонения на 13% по сравнению с использованием только одного CASA (28%). В целом, эти результаты демонстрируют очень высокий авторитет многопараметрического подхода при принятии решения об отклонении / принятии партии семени.
Детальный анализ принятых и отклоненных с помощью CASA / проточной цитометрии партий по сравнению со стандартным контролем качества показал 77,4% совпадения решений, принятых с использованием двух разных методов оценки качества, но 22,6% образцов не соответствовали друг другу (рис. 74.3). Это несоответствие можно рассматривать как «влияние точности» многопараметрического метода над стандартной субъективной оценкой. Т.е. эти 22,6% состоят из 10,8% партий, принятых стандартными методами, которые были бы отклонены с помощью наших многопараметрических инструментов, и 11,8% партий, отклоненных стандартными методами, которые были бы приняты при использовании многопараметрического подхода.
(a) (b)
10 5 10 5
10 4 10 4
10 3 10 3
10 2 10 2
10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5
FSC-A FSC-A
(c) (d)
10 5 Сперматозоиды 10 5 Сперматозоиды
10 4 10 4
10 3 10 3
Прочие частицы
Прочие частицы
10 2 10 2
10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5
FSC-A FSC-A
(e) (f)
10 5 10 5
10 4 10 4
10 3 10 3
10 2 10 2
10 2 10 3 10 4 10 5 10 2 10 3 10 4 10 5
FSC-A FSC-A
SSC-A SSC-A
Hoechst-A Hoechst-A
SSC-A SSC-A
Рис. 74.2 Сравнение (а) хорошего и (б) плохого отделения сперматозоидов от несперматических частиц в размороженных эякулятах. Мечение клеток с помощью Hoechst 33342 (синие клетки в c, d) позволяет исключить окрашивание сперматозоидов и различать клеточный дебрис (мусор) и несперматические частицы из яичного желтка. Распознанную популяцию сперматозоидов можно использовать для дальнейшего многопараметрического анализа (e, f). SSC - график бокового рассеяния; FSC - график прямого рассеяния.
На первый взгляд, 22,6% расхождений между объективной и субъективной оценкой могут показаться высокими. Однако, при CASA / проточной цитометрии было бы отбраковано 268 партий (таблица 74.2), при этом было принято 392 партии по сравнению с исходными принятыми 385 и 275 отклоненными SPC. Это различие составляет 1% от всей поступившей на оценку спермы (7 партий из 660) и может рассматриваться как «производственное влияние» CASA / проточной цитометрии по сравнению со стандартным контролем качества. Это исследование показывает, что производственное влияние будет незначительным, но влияние точности будет весьма значительным.
Чтобы оценить влияние этого многопараметрического подхода на фертильность спермы в полевых условиях, мы применили этот анализ к партиям спермы с известной фертильностью, которые были реализованы (т.е. осеменены животные) в полевых условиях после использования стандартного контроля качества. CASA и проточная цитометрия были выполнены на 192 партиях с не менее 250 первых осеменений. Фертильность, связанная с каждой партией, была получена из Канадской молочной сети и выражена как FERTSOL, что представляет 56-дневный невозвратный коэффициент, скорректированный с учетом нескольких параметров, включая сезон осеменения, осеменатора, кратность осеменения и т. д.
Таблица 74.1 Предельные значения CASA / проточной цитометрии, используемые для определения показателей прохождения/непрохождения во время контроля качества размороженной спермы сразу после оттаивания и после 2 часов воздействия терморезистентного стресса. Партии спермы, соответствующие этим пороговым значениям или превышающие их, прошли оценку.
| Параметр | После оттаивания | После 2-х часовой выдержки |
|---|---|---|
| Общая подвижность (%) | 40 | 35 |
| Прогрессивная подвижность (%) | 15 | 10 |
| Неповрежденная акросома (%) | 66 | 61 |
| Клетки с неповрежденной мембраной (%) | 40 | 40 |
| Митохондриальная активность (%) | 40 | 45 |
Таблица 74.2 Количество (%) отбракованных образцов (всего 660), по крайней мере, по одному параметру контроля качества на основании только CASA, только проточной цитометрии или CASA плюс проточная цитометрия.
| После оттаивания Параметр (0 часов) | После 2-х выдержки | часовой 0 часов+ 2 часаa |
|---|---|---|
| Только CASA | ||
| Общая подвижность (%) 76 (12) | 157 (24) | 163 (25) |
| Прогрессив. подвижность (%) 70 (11) | 137 (21) | 151 (23) |
| Всего CASA 94 (14) | 178 (27) | 188 (28) |
| Только проточная цитометрия | ||
| Неповрежденная акросома (%) 104 (16) | 97 (15) | 117(18) |
| Клетки с неповрежденной мембраной (%) 132 (20) | 144 (22) | 159 (24) |
| Митохондриальная активность (%) 133 (20) | 208 (32) | 212 (32) |
| Всего проточная цитометрия 156 (24) | 214 (32) | 224 (34) |
| Всего CASA+проточная цитометр. 176 (27) | 260 (39) | 268 (41) |
| a Уникальные партии, отклоненные спустя 0 часов уникальные партии, отклоненные после 2-х часовой стресса). При использовании нашего многопараметрического | (т.е. сразу после инкубации | оттаивания) + (терморезистентного подхода 9,4% |
| (18 из 192) партий спермы были бы реализации. Эти партии соответствовали фертильностью (< –1 FERTSOL), | утилизированы 5,3% 3,6% спермы | до их спермы с низкой средней |
| фертильности (от -1 до +1 FERTSOL) и | 0,5% спермы | с высокой |
| фертильностью (> +1 FERTSOL). | Опять | же, этот |
| многопараметрический подход увеличил спермы, поступившей на реализацию. | бы общую | фертильность |
Конкретные применения многопараметрического подхода к оценке спермы
Многофакторный аспект фертильности может привести к неправильной оценке качества спермы при оценке лишь нескольких параметров. Даже сперма, прошедшая строгие этапы контроля качества, может иметь низкую фертильность после полевых испытаний.
Отклонено стандартом.
Отклонено CASA / FC
29.8%
Принят стандартом.
Отклонено CASA /
FC 10,8%
Отклонено
стандартом.
Принято CASA / FC
11,8%
Принят стандартом.
Принято CASA / FC 47,6%
Рис. 74.3 Сравнительный анализ процентного соотношения допущенных/не допущенных к реализации образцов спермы между стандартной QC и CASA / проточной цитометрией во время контроля качества 660 размороженных партий спермы.
Такие партии прошли бы все наши пороговые значения CASA/ проточной цитометрии, но все же дали бы меньше телят, несмотря на большое число осеменений. Необходим более подробный анализ этой спермы, чтобы понять причину ее низкой фертильности. Однако, более глубокий анализ образцов спермы требует много времени и средств, поэтому он проводится только для высококачественной спермы. Здесь мы сообщаем о двух случаях, когда проточная цитометрия помогла нам выявить предполагаемую причину низкой фертильности семени. В первом случае был молодой бык (бык А), одна из партий спермы которого произвела очень мало эмбрионов после экстракорпорального оплодотворения по сравнению со среднестатистическим показателем. Эту партию спермы сравнивали (в трех экземплярах) с партией среднего быка (бык С), используемой в качестве внутреннего контроля для большинства наших экспериментов. Параметры подвижности и жизнеспособности, оцененные с помощью CASA/проточной цитометрии, показали среднее качество сперматозоидов от обоих быков (в среднем 36% общей подвижности и 15% прогрессивной подвижности). Оценка уровня внутриклеточного кальция и целостности акросомной мембраны проводилась сразу после оттаивания и через 5 часов инкубации после оттаивания с гепарином при 38,5 °C. В обоих случаях аликвоту (часть образца, пробу) сперматозоидов инкубировали с ацетоксиметилом Indo-1 и агглютинином арахиса FITC, а затем обрабатывали тапсигаргином, чтобы вызвать внутриклеточный каскад, участвующий в процессе капацитации. Процент живых сперматозоидов с высоким внутриклеточным уровнем кальция и прореагировавших акросом определяли методом проточной цитометрии. Анализ сразу после оттаивания перед инкубацией с гепарином и введением тапсигаргина показал аналогичный процент клеток с прореагировавшими акросомами, и клеток с высоким внутриклеточным кальцием между быком A и быком C. После стимуляции тапсигаргином аналогичный процент сперматозоидов из каждой акросомы быка прореагировал, но сперма от быка A показала увеличение клеток с высоким содержанием кальция по сравнению с быком C (23,3 ± 6,3% против 13,3 ± 2,5%, соответственно; P = 0,14) (таблица 74.3).
