В настоящее время доступно несколько моделей инструментов CASA для оценки качества и подвижности сперматозоидов. Каждая система работает по схожим принципам, но они различаются настройками параметров и используют разные алгоритмы для определения скорости и траекторий. Настройки параметров, пороговые значения, частота кадров видео и другие переменные будут влиять на результаты CASA, как было рассмотрено Дэвисом и Кацем.23 Как упоминалось выше, новые технологии и программное обеспечение CASA быстро развиваются. Наша лаборатория провела небольшое исследование, измерив способности CEROS (Hamilton-Thorne, США) и анализатора класса сперматозоидов (SCA; Microptics, Испания) к оценке подвижности и концентрации размороженных бычьих сперматозоидов в яичном разбавителе (неопубликованные данные). В общей сложности с помощью обеих систем было проанализировано 18 разных замороженно-размороженных эякулятов, и были сравнены средние проценты общей и прогрессивной подвижности, концентрация, средняя скорость движения, криволинейная скорость, прямолинейная скорость, поперечная частота биений и амплитуда бокового смещения головки (Рисунок 74.1). Среди всех проанализированных параметров только процент от общего количества подвижных клеток почти не отличался между системами. Расхождения можно объяснить лучшей способностью SCA исключать частицы яичного желтка из анализа. SCA распознал несперматические частицы по размеру в микронах, в то время как CEROS использовал пиксели для оценки размера клеток. Различия в алгоритмах, используемых для подсчета медленных, средних и быстрых сперматозоидов, также могут объяснить различия в подвижности и кинетических параметрах, наблюдаемые между каждой системой. В целом, это мини-исследование указывает на высокую вариабельность между системами CEROS и SCA при оценке параметров подвижности сперматозоидов.
Анализ функции спермы методом проточной цитометрии
Проточная цитометрия анализирует клетки, взвешенные в потоке жидкости, проходящей с высокой скоростью перед одним или несколькими лазерами. Свет, излучаемый связанными с флуорохромом клетками, улавливается фотоумножителями и преобразуется в электронный сигнал, который затем переводится в цифровую форму с помощью программного обеспечения. Ключевыми особенностями проточной цитометрии являются сбор и анализ тысяч клеток за секунды и мультипараметрический потенциал технологии. Самые современные цитометры обычно оснащены тремя лазерами и не менее 10 фотоумножителями, что позволяет метить клетки одновременно несколькими зондами и, таким образом, анализировать множество параметров одновременно. В последние несколько лет многопараметрический аспект проточной цитометрии позволил этой технологии стать популярным инструментом для оценки свойств сперматозоидов.24–26 Был разработан широкий спектр флуорохромов для оценки многочисленных характеристик сперматозоидов. Здесь мы рассмотрим некоторые флуорохромы, используемые для изучения сперматозоидов с помощью проточной цитометрии.
Характеристики сперматозоидов, анализируемые с помощью проточной цитометрии
Жизнеспособность / смертность
Йодид пропидия - самый популярный краситель, используемый для идентификации мертвых клеток. Этот флуорохром способен проникать в сперматозоиды с поврежденными клеточными мембранами и связываться с ДНК, где его можно возбудить с помощью 488-нм лазера, присутствующего в большинстве цитометров.27–29
Йодид пропидия часто используется в сочетании с SYBR-14, другим ДНК-метящим зондом.30,31 SYBR-14 также возбуждается 488-нм лазером и представляет собой проникающий зонд, окрашивающий все клетки. Одновременно добавленный к клеткам йодид пропидия замещает или гасит флуоресценцию SYBR-14 в поврежденных клетках. Также для оценки жизнеспособности клеток теперь доступен новый фиксируемый краситель, выпускаемый Invitrogen под названием Live/Dead® - набор для фиксации мертвых клеток.32 Этот краситель вступает в реакцию с аминами на поверхности жизнеспособных клеток или внутри цитоплазмы клеток с поврежденными мембранами. Окрашивание аминов на поверхности жизнеспособных клеток приведет к относительно тусклому окрашиванию по сравнению с ярким окрашиванием мертвых клеток. Этот фиксируемый краситель принадлежит к крупному семейству, способен к возбуждению/ излучению различными длинами волн, что позволяет использовать его в большинстве цитометров.
Целостность акросомы
Оценка акросомного статуса в основном проводится с использованием растительных лектинов, распознающих акросомные лиганды. Агглютинин гороха (Pisum sativum) связывает маннозные и галактозные фрагменты акросомного матрикса. Поскольку агглютинин Pisum sativum не может проникнуть через неповрежденную акросомную мембрану, будут окрашены только сперматозоиды с прореагировавшей или поврежденной акросомой.21,33,34 Однако, было показано, что этот агглютинин имеет сродство (аффинность, как, например антиген с антителом) к яичному желтку и неспецифическим сайтам связывания на поверхности сперматозоидов.35,36 Этот аспект может стать проблемой при анализе спермы, замороженной в разбавителе на основе яичного желтка, и привести к неправильной интерпретации акросомного статуса сперматозоидов. Агглютинин Arachis hypogaea (арахис) связывает галактозные фрагменты внешней мембраны акросомы и является наиболее популярным лектином, используемым для изучения целостности акросомной мембраны с помощью проточной цитометрии.37–39 Кроме того, агглютинин Arachis hypogaea кажется наиболее надежным зондом для идентификации сперматозоидов с поврежденной акросомой, поскольку он в меньшей степени связывается с другими участками сперматозоидов.40 Агглютинин Pisum sativum и агглютинин Arachis hypogaea обычно маркируются флуорохромами FITC, что позволяет использовать их во всех цитометрах.
Митохондриальная активность
Митохондрии - очень важные органеллы, участвующие в первую очередь в генерации энергетических субстратов для подвижности сперматозоидов. Родамин 123 был одним из первых зондов для мониторинга митохондриальной активности.41,42 Родамин 123 изолируется в активных митохондриях и вымывается из клетки при потере мембранного потенциала. Эта характеристика ограничивает его использование, когда требуется количественная оценка или когда требуется фиксация сперматозоидов. Решением проблемы с фиксацией может стать краситель Mitotracker®. Этот краситель накапливается и окрашивает активные митохондрии и имеет преимущество в том, что он способен возбуждать и излучать флуоресценцию в различных диапазонах.42–44 Самым популярным зондом для оценки митохондриальной активности является JC-1 (5,5', 6,6'-тетрахлор-1,1', 3,3' тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид).45–47 В сперматозоидах, содержащих митохондрии с высоким мембранным потенциалом, JC-1 проникает в матрикс митохондрий, где он накапливается, образует J- агрегаты и приобретает флуоресцентный красный цвет. В сперматозоидах, содержащих митохондрии с низким мембранным потенциалом, JC-1 не может накапливаться в митохондриях и остается в цитоплазме в зеленой флуоресцентной мономерной форме.
Концентрация VAP
p=0.029 p<0.001
80 100
70 90
80
60
70
50
60
40 50
30 40
30
20
20
10 10
0 0
CEROS SCA CEROS SCA
Общая подвижность VSL
p=0.704 p<0.001
70 90
80
60
70
50
60
40 50
30 40
30
20
20
10
10
0 0
CEROS SCA CEROS SCA
Прогрессивная подвижность VCL
p=0.029 p<0.001
40 160
35 140
30 120
25 100
20 80
15 60
10 40
5 20
0 0
CEROS SCA CEROS SCA
ALH ALH
p<0.001 p<0.001
8 8
7 7
6 6
5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
CEROS SCA CEROS SCA
M/mL m/Sµ
%
µm/S
%
m/Sµ
mµ mµ
Рис. 74.1 Сравнение CEROS (Hamilton-Thorne) и SCA (анализатор класса сперматозоидов) для определения концентрации, процента общей и прогрессивной подвижности, бокового смещения головки (ALH), средней скорости движения (VAP), скорости по прямой (VSL), криволинейной скорости (VCL) и перекрестная частота биений (BCF) из 18 различных замороженно-размороженных эякулятов крупного рогатого скота. Столбцы представляют собой средние значения ± SEM. Значение P <0,05 указывает на статистически значимую разницу между CEROS и SCA, парным t-критерием Стьюдента (используется для сравнения данных до и после, т.е. парных данных) .
JC-1 имеет преимущество по сравнению с Rhodamine 123 и Mitotracker в том, что он может количественно определять митохондриальный взрыв клетки. Недостатком зонда JC-1 является его двойное флуоресцентное излучение, которое ограничивает его комбинацию с другими зондами, излучающими на зеленой и красной длинах волн.
Целостность ДНК
Для определения потенциальной фертильности сперматозоидов важно оценить статус хроматина. В последние годы основным методом, используемым для оценки целостности хроматина в сперматозоидах с помощью проточной цитометрии является анализ структуры хроматина сперматозоидов, разработанный Evenson и Jost48 , является.49,50 В анализе структуры хроматина сперматозоидов используется двойное флуоресцентное излучение акридинового оранжевого в зависимости от того, связывается ли он с одноцепочечной ДНК (красная флуоресценция) или двухцепочечной ДНК (зеленая флуоресценция) (акридиновый оранжевый - флуорохроматический краситель, который связывается с нуклеиновыми кислотами бактерий и других клеток и под действием ультрафиолетового излучения акридиновый оранжевый окрашивает РНК и однонитевую ДНК в оранжевый цвет, двунитевую ДНК — в зеленый). После стадии денатурации образец спермы инкубируют с акридиновым оранжевым и затем анализируют посредством проточной цитометриии. Денатурация (потеря структуры и естественных свойств) приведет к образованию одноцепочечной ДНК при наличии разрывов ДНК и создаст разнородную популяцию красной и зеленой флуоресценции в зависимости от целостности хроматина. Наиболее важным результатом анализа структуры хроматина сперматозоидов является соотношение красно-зеленой и красной флуоресценции, называемое индексом фрагментации ДНК, где высокий индекс фрагментации ДНК коррелирует с высоким уровнем ее повреждения. Индекс фрагментации ДНК показал корреляцию с фертильностью у разных видов.51–53 Большой спектр люминесценции, охватываемый акридиновым оранжевым, и стадия денатурации, необходимая для индукции одноцепочечной ДНК, являются двумя основными недостатками анализа структуры хроматина сперматозоидов при многопараметрическом анализе. Акридиновый оранжевый флуоресцирует в зеленом и красном спектре; это оставляет мало возможностей для добавления других флуорохромов в этих спектральных областях, а стадия денатурации выполняется с раствором кислоты / детергента, несовместимым со всеми зондами. Другой анализ для оценки целостности ДНК, разработанный для проточной цитометрии, - это анализ TUNEL (мечение концов терминальной трансферазы dUTP), который может идентифицировать разрывы цепи ДНК.54–56 Фермент трансфераза включает флуоресцентно модифицированные нуклеотиды в местах разрыва ДНК. Затем полученные меченые клетки можно анализировать с помощью проточной цитометрии. Анализ TUNEL позволяет количественно определять меченые нуклеотиды в составе фрагментированной ДНК, которые проявляются увеличением флуоресценции, что дает заметное преимущество перед анализом структуры хроматина сперматозоидов.
Кальциевый насос
Кальциевый насос - один из основных этапов процесса капацитации сперматозоидов. Повышение уровня внутриклеточного кальция в конечном итоге приводит к фосфорилированию остатков тирозина и серина в белках, регулирующих сигнальный каскад. Самым популярным красителем, используемым для определения внутриклеточной концентрации кальция в сперматозоидах, является зонд семейства Fluo-3/4, возбуждаемый лазером с длиной волны 488 нм.57-59 Не связанный с кальцием Fluo-3 является нефлуоресцентной молекулой, но когда ионы кальция проникают в клетку и связывают Fluo-3, последний становится флуоресцентным Fluo-4 - производным Fluo-3, обладающим более высокой флуоресценцией.
Fura red - это зонд, также возбуждаемый лазером с длиной волны 488 нм, флуоресцентное излучение которого уменьшается при связывании кальция. Двойная маркировка сперматозоидов с помощью Fluo-3 / Fura red позволяет рассчитать соотношение несвязанного и связанного кальция. Отношение между двумя средними интенсивностями флуоресценции (Fluo-3 / Fura red) пропорционально внутриклеточной концентрации кальция в сперматозоидах. Этот экспериментальный подход был использован Peña и др.60 для оценки спермы собак. Одним из важнейших аспектов использования этих красителей является загрузка зонда в клетки. Поскольку средняя интенсивность флуоресценции является параметром, используемым для обозначения уровня внутриклеточного кальция, ошибки при пипетировании зонда изменят среднюю интенсивность и приведут к неверной интерпретации результатов. Недостатком комбинации Fluo-3 / Fura red является необходимость в наличии двух разных детекторов флуоресценции, что уменьшает возможности многопараметрического подхода. Пентаацетоксиметиловый эфир Indo-1 представляет собой проницаемый для мембран кальциевый сенсорный краситель, используемый для мониторинга изменений уровня внутриклеточного кальция. Как только Indo-1 попадает в клетку, эстеразы расщепляют ацетоксиметильную группу, образуя проницаемый для мембран краситель. Несвязанный Indo-1 имеет максимум излучения при 485 нм. При связывании кальция пик излучения смещается до 410 нм. Измерение во времени можно представить как отношение двух длин излучаемых волн. Поскольку Indo-1 ацетоксиметил является ратиометрическим зондом, проблемы загрузки клеток (как и для Fluo-3/4) менее важны. Одним из ограничений этого зонда является то, что не все лаборатории оснащены прибором с ультрафиолетовым лазером, необходимым для возбуждения ацетоксиметила Indo-1. Для тех, у кого есть этот прибор, Indo-1 ацетоксиметил становится очень хорошим датчиком для многопараметрического анализа, потому что это один из немногих датчиков, использующих ультрафиолетовый лазер, что оставляет лучи в 488 и 633 нм дсвободными для изучения других параметров.
Ограничения проточной цитометрии
На выбор цитометра для анализа сперматозоидов влияет несколько факторов. Цена инструмента остается основным фактором. Многопараметрический анализ обычно выполняется с помощью приборов, содержащих более одного лазера и несколько фотоэлектронных умножителей, что существенно увеличивает стоимость оборудования. Действительно, тип выполняемого анализа также является фактором, определяющим выбор проточного цитометра. В зависимости от целей племенного центра и схемы эксперимента необходимо учитывать комбинацию лазеров (количество и длину волны) и количество фотоумножителей, включенных в прибор. Прибор только с одним лазером и тремя фотоэлектронными умножителями позволяет обнаруживать максимум три параметра на каждой ячейке, в то время как многопараметрический анализ, включающий четыре или более параметров, обычно требует прибора, имеющего по крайней мере два лазера и четыре фотоумножительных трубки. Программное обеспечение, управляющее проточным цитометром, является еще одним важным аспектом при выборе прибора. Большинство доступных программных продуктов довольно просты и понятны для начинающего пользователя. Однако, для работы с некоторым ПО требуются определенные знания принципов проточной цитометрии, что затрудняет работу с прибором. Например, образцы, окрашенные смесью, содержащей несколько зондов, подвергаются стробирующему анализу (стробирование -метод выделения некоторого интервала на временной оси, шкале частот и т.п. для увеличения вероятности обнаружения полезных сигналов на фоне помех. Т.е. это включение приемника волн только в момент предполагаемого прихода к нему сигнала) . Чтобы получить репрезентативные результаты, входы (датчика?) должны быть связаны с определенной популяцией в правильной иерархии, и с этим трудно справиться с некоторым программным обеспечением для начинающего пользователя.
