Воспроизводство крупного рогатого скота

Глава 58

Инфекционные агенты: Бруцеллез

Sue D. Hagius, Quinesha P. Morgan и Philip H. Elzer

Кафедра ветеринарных наук, Университет штата Луизиана, Батон-Руж, Луизиана, США

Вступление

Бруцеллез является инфекционным бактериальным заболеванием человека и копытных животных, вызванным видами бруцелл. Это распространенное по всему миру зоонозное заболевание, которое оказывает значительное влияние на экономику и здоровье человека. Болезнь поражает людей и животных с древних времен, так как антропологические данные свидетельствуют о наличии организма в карбонизированном (обугленном) сыре и о типичных поражениях костей у человеческих останков в районах, пострадавших от извержения Везувия в 79 году нашей эры.¹ Инфицирование человека обычно происходит из-за контакта с животными или продуктами животного происхождения, контаминированными бактериями. Болезнь животных в Соединенных Штатах контролировалась с помощью вакцинации и программы по ликвидации болезни, хотя бактерии все еще сохраняются в определенных популяциях в дикой природе. Бруцеллез остается проблемой в странах, где программы борьбы с болезнями животных не снижают уровень инфекции среди животных. Управление и контроль бруцеллеза у животных является ключом к профилактике заболевания у человека.

Род Brucella состоит из шести классических видов, которые обычно связаны с определенным хозяином: Brucella abortus (крупный рогатый скот); B. melitensis (козы и овцы); B. suis (свиньи); B. canis (собаки); B. ovis (овцы); и B. neotomae (пустынная лесная крыса). Относительно новые виды были выделены у морских млекопитающих: B. pinnipedialis (тюлени, морские львы и моржи) и B. ceti (киты, морские свиньи и дельфины) имеют неизвестное значение и потенциально могут заразить людей.^2,3 Brucella microti, найденная в обыкновенной полевке, рыжих лисицах и почве в некоторых районах Европы, обладает неизвестной патогенностью для скота и человека.⁴ Благодаря появлению молекулярных технологий было предположено существование нескольких новых нетипичных видов из-за их генетического сходства с классическими бруцеллами.^5–8 Хотя бруцеллы имеют явное предпочтение к конкретному выбранному хозяину, они способны заражать и других позвоночных. Бруцеллез крупного рогатого скота в основном вызывается B. abortus и приводит к аборту и бесплодию, но B. melitensis и B. suis могут инфицировать крупный рогатый скот и вызвать ряд симптомов. Brucella spp. являются факультативными внутриклеточными патогенами, которые можно выращивать в лабораторных условиях в обогащенных питательных средах, отобранных для привередливых микроорганизмов в аэробной атмосфере при 37°C. Лабораторные штаммы обычно производят отдельные колонии в течение 2–5 дней, но изолятам животных из инфицированных тканей может потребоваться до 4 недель для роста на селективных средах.

Организмы представляют собой небольшие грамотрицательные коккобациллы (бактерии, имеющие промежуточную между бациллами (палочковидными бактериями) и кокками (сферическими бактериями) форму) , которые являются каталазо-положительными, немобильными и обладают различной оксидазной и уреазной активностью. Идентификация видов и биоваров достигается с помощью чувствительности к красителям, типирования фагов и молекулярного анализа. Виды классифицируются на «гладкие» и «шероховатые» формы в зависимости от состава их внешней липополисахаридной мембраны (LPS). Гладкие виды (B. abortus, B. melitensis, B. suis) имеют полную O- полисахаридную группу (OPS), в то время как шероховатые виды (B. canis и B. ovis) лишены этой полисахаридной цепи или обладают только ее частью.⁹ Это влияет на морфологию колоний и может быть использовано как в микробиологическом, так и серологическом анализе при определении видов и штаммов.

Бруцеллез животных является классическим репродуктивным заболеванием, приводящим к аборту, мертворождению и слабому потомству. Он может негативно повлиять на фертильность и молочную продуктивность. Хронически инфицированные животные, у которых нет клинических признаков, представляют угрозу для наивных животных и обслуживающего их персонала. Наличие этой болезни в регионе или стране может привести к введению международных постановлений, ограничивающих перемещение животных и торговлю ими, что отрицательно влияет на экспорт и экономику.

Brucella melitensis

Brucella melitensis , первый из описанных видов рода Brucella, вызывает аборты у самок коз и овец, односторонний орхит у самцов и мальтийскую лихорадку у людей.¹⁰ Открыл организм британский военный хирург Сэр Дэвид Брюс в 1887 году как возбудителя средиземноморской или мальтийской лихорадки.¹¹ Предпочтительными хозяевами могут быть козы и овцы, но этот организм наименее видо-специфичный из бруцелл¹⁰ , и в странах с высокой распространенностью этой инфекции среди мелких жвачных животных его нередко выделяют у крупного рогатого скота.¹²

Хотя овцы и козы и их продукты являются основным источником заражения людей, B. melitensis у крупного рогатого скота также стал представлять серьезную проблему в некоторых странах южной Европы, Израиле, Кувейте и Саудовской Аравии. Заболевание коз очень напоминает заболевание, наблюдаемое у крупного рогатого скота, инфицированного B. abortus.¹³

Инфекция Brucella melitensis особенно проблематична, поскольку вакцины B. abortus не обеспечивают эффективной защиты от этого вида.

Таким образом, заражение крупного рогатого скота B. melitensis становится все более серьезной проблемой общественного здравоохранения в некоторых странах. Считалось, что Соединенные Штаты свободны от этого патогена; однако в октябре 1999 г. было обнаружено, что четыре коровы и несколько коз и овец в Южном Техасе инфицированы B. melitensis.¹⁴ Вероятным источником вспышки были козы из северной Мексики, которые, возможно, пересекли границу и смешались с этим стадом.

Brucella suis

Бруцеллез, вызванный B. suis, впервые был описан Дж. Траумом в 1914 году в стаде свиней в Индиане. Хотя первоначально он считался патогенным B. abortus, позднее он был назвал И.Ф. Хадлсоном B. suis.¹⁵ Домашние и дикие свиньи являются естественными хозяевами B. suis.^16–18 У свиноматок основным признаком заболевания является аборт, который может произойти на любой стадии супоросности. Зараженная свиноматка может родить как здоровых живых поросят, так и мертвых или слабых. У хряков бруцеллы могут присутствовать в сперме без каких-либо внешних признаков заболевания. У них могут наблюдаться односторонние отеки и атрофия придатков и семенников, что обычно приводит к бесплодию. Сообщалось о хромоте; опухшие суставы, бурсы и сухожилия; паралич из-за образования абсцесса возле позвоночника. Бруцеллез, вызванный B. suis, считается венерическим заболеванием, передаваемым от зараженного хряка неинфицированным свиноматкам.¹⁵ Поскольку от свиней не производят молочные продукты, заболевание среди людей в основном ограничивается охотой на диких свиней и представляет собой профессиональную опасность для фермеров, ветеринаров и работников скотобоен. Тем не менее, B. suis может заразить крупный рогатый скот, который имел прямой контакт с дикими свиньями, что приведет к распространению этого зоонозного патогена при потреблении непастеризованных молочных продуктов.^19,20

Brucella abortus

Brucella abortus, первоначально выделенная как Bacillus abortus Bang в 1897 году и в конце концов переименованная в 1920 году, является этиологическим агентом бруцеллеза крупного рогатого скота, инфекции, которая приводит к самопроизвольным абортам, преждевременным отелам и бесплодию у коров. При родах плод, плацента, маточная жидкость и молоко содержат большое количество бактерий, которые выбрасываются в окружающую среду, потенциально заражая наивных животных или персонал фермы.^13,21

У крупного рогатого скота бруцеллез - это, прежде всего, болезнь самок. Быки могут быть заражены, но они не так легко распространяют болезнь. Организм локализуется в яичках быка, что приводит к орхиту. У самок организм локализуется в вымени, матке и лимфатических узлах, прилегающих к матке. У инфицированных коров наблюдаются симптомы, которые могут включать аборт в течение последнего триместра беременности, задержание последа и слабых телят при рождении.¹³ Зараженные коровы обычно абортируют только один раз. Последующие телята могут родиться слабыми или здоровыми и нормальными. Некоторые инфицированные коровы не проявляют никаких клинических симптомов заболевания и рожают нормальных телят. Миллионы организмов (Brucella abortus) попадают в послед и жидкости в связи с отелом и абортом. Болезнь распространяется при поедании коровами зараженного корма, либо вылизывании телят или абортированных плодов от зараженных коров. Как только начинается лактация, организм мигрирует в лимфатическую систему, связанную с молочной железой, превращая молоко в потенциальный источник инфекции человека.

Этот вид способен преодолевать видовой барьер, поражая как скот, так и человека.²² В животноводстве это приводит к убыткам в миллиарды долларов из-за репродуктивных последствий у крупного рогатого скота. Он также числится в качестве гражданского, военного и сельскохозяйственного агента биотерроризма.

Патогенность

Патогенные виды бруцелл являются внутриклеточными патогенами, которые способны к выживанию и репликации внутри фагоцитарных и нефагоцитарных клеток млекопитающих хозяев, что важно для вирулентности.²³ После проникновения в эпителий слизистой оболочки бактерии транспортируются в регионарные лимфатические узлы. Распространение и размножение бруцелл в лимфатических узлах, селезенке, печени, костном мозге, молочных железах и половых органах происходит через макрофаги. Увеличение количества бруцелл у хозяина происходит главным образом благодаря способности организма избегать механизмов уничтожения макрофагов. Вирулентные виды Brucella не только противостоят уничтожению нейтрофилами после фагоцитоза^24–26 , но также размножаются внутри макрофагов²⁷ и "непрофессиональных" фагоцитов (не имеют на своей поверхности молекулы, называемые рецепторами, которые обнаруживают чужеродные объекты) .²⁸ Бруцеллы способны обосновываться в репликативных фагосомах внутри макрофагов хозяина для продления внутриклеточного выживания. Повидимому, они также способны противостоять воздействию активных промежуточных соединений кислорода, кислотного pH и недостатка питательных веществ в течение своего пребывания в различных макрофагах хозяина, включая мышей, людей и крупный рогатый скот.^23,29– 33 Существуют доказательства того, что гладкий ЛПС (липополисахарид клеточной стенки бактерий, который бывает S (smooth -гладкой) и R (rough - шероховатой) формы) , вероятно, играет жизненно важную роль во внутриклеточной выживаемости, поскольку гладкие формы, как правило, выживают гораздо эффективнее, чем шероховатые.^34,35

Макрофаги, содержащие бактерии, попадают в лимфатический узел через лимфатические сосуды.^13,36 В течение 2–3 недель лимфатический узел становится геморрагическим из-за разрушения сосудов внутри него. Некоторые макрофаги в лимфатическом узле лизируются, и бруцеллы выделяются в кровоток, что приводит к последующей бактериемии.^13,36,37 Бактерии мигрируют по всему организму хозяина, локализуясь в ретикулоэндотелиальной системе. У копытных животных во время беременности бруцеллы размножаться в больших количествах внутри трофобластических клеток плаценты.^13,36,38,39 Механизм инвазии нефагоцитарных клеток, таких как плацентарные трофобласты, четко не установлен. Внутри нефагоцитарных клеток бруцеллы имеют тенденцию локализоваться в шероховатой (гранулярной) эндоплазматической сети. Плацентарные трофобласты являются частью эпителиальных слоев плаценты естественного хозяина. Они служат важным связующим звеном между кровообращением матери и плода. Известно, что во время поздней беременности бруцеллы реплицируются в плацентарных трофобластах своего естественного хозяина - жвачных животных, вызывая нарушение целостности плаценты, инфекцию плода и, возможно, аборт или рождение слабых или инфицированных животных.⁴⁰

Плацентарными трофобластами жвачных в больших количествах вырабатывается эритритол, который может служить стимулятором роста бруцелл.¹³ Дальнейшие эксперименты с использованием микроскопического анализа плацентарных тканей от коров и коз, инфицированных B. abortus, также показали, что бруцеллы реплицируются во внутриклеточных компартментах, связанных с шероховатым эндоплазматическим ретикулумом трофобластов, предполагая, что внутриклеточная среда похожа на среду внутри макрофагов хозяина.^38,41,42 Точный механизм, по которому внутриутробная инфекция вызывает аборты, неясен. В качестве причины абортов было предложено вмешательство в кровообращение плода из-за плацентита.⁴³

Диагностика

Для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота можно использовать три метода: 1) серологический - обнаружение антител к бактериям; 2) бактериологический - выделение организма из тканей животных; и 3) молекулярно биологический с использованием молекулярных методов для выделения и идентификации бактериальной ДНК (ПЦР) . Серологический метод обычно используется для тестирования животных, потому что результаты могут быть получены за короткий период времени. Все серологические тесты основаны на связывании бычьих антител с антигенами бруцелл. Обычно страна будет следовать предлагаемым серологическим методам OIE (Всемирная организация по охране здоровья животных) или МСХ США.^44,45 Стандартные серологические тесты включают Роз-бенгал тест (РБТ) (реакция агглютинации, проводимая посредством смешивания на стекле сывороток с суспензией окрашенных клеток B. abortus) , тест молочного кольца ( антиген Brucella, окрашенный гематоксилином, добавляют к молоку - любые агглютинины в молоке, которые переносятся молочным жиром, когда он поднимается на поверхность, реагируют с антигеном) , Кард-тест (тест на агглютинацию для выявления антител к B. abortus) , риваноловый тест, метод стандартных пробирок (STT), буферный подкисленный планшетный тест на антиген и тест фиксации комплемента. Основные тесты на связывание включают иммуноферментный анализ концентрации частиц (PCFIA), непрямой и прямой конкурентный иммуноферментный анализ (ELISA) и поляризационный флуоресцентный анализ (FPA). Современные надзорные меры в США включают тест молочного кольца для проверки молочных заводов и серологическое тестирование крупного рогатого скота. В идеале, для постановки окончательного диагноза можно использовать серологию в сочетании с культивированием бруцелл или молекулярным типированием.^46,47 Идентификация серологически положительного животного запускает принятый регуляторный процесс, который может включать тестирование и убой, карантин, вакцинацию и корректировку управления стадом. При обнаружении заболевания у человека проводят соответствующую антибиотикотерапию после выяснения вида бактерий. Эпидемиологический надзор обычно требует видовой состав, поэтому можно использовать все три методологии.

Иммунная реакция

Иммунный ответ хозяина на типичный вирулентный штамм B. abortus включает как клеточные, так и гуморальные реакции. Гуморальный аспект включает выработку антител, которые нацелены на поверхностные компоненты внешней мембраны клетки. Было показано, что комплемент неэффективен в борьбе с B. abortus напрямую, но может помочь при фагоцитозе.⁴⁸ Основным иммуногенным элементом гладкой наружной мембраны является OPS-часть (О-боковые связи (перосамин) липополисахарида (LPS) на поверхности бактериальной клетки) LPS. Антительный ответ хозяина на OPS недостаточен для обеспечения защиты от инфекции. Эффективность шероховатого вакцинного штамма RB-51, в котором отсутствует OPS, также демонстрирует, что гуморальный ответ не имеет первостепенного значения. Антитела IgG-1, преимущественно продуцируемые в ответ на B. abortus, не коррелируют с элиминацией патогена.⁴⁹ Антитела могут способствовать внутриклеточному уничтожению посредством опсонизации и замедлять скорость размножения внутриклеточного B. abortus, но одни только антитела не могут защитить хозяина от бактерий.^48–50

С точки зрения вакцинации крупного рогатого скота, должен быть вызван клеточный иммунный ответ для защитного иммунитета. Клеточноопосредованная иммунная реакция хозяина на B. abortus в основном достигается активацией Т-клетками адаптивного иммунного ответа. Функция клеточного иммунитета заключается в поиске и уничтожении клеток-хозяев, содержащих внутриклеточные патогены, такие как вирусы и факультативные или облигатные внутриклеточные бактерии.⁵¹

Макрофаг в первую очередь ответственен за проглатывание и выведение бруцелл из внеклеточной среды. Презентация антигена как CD4, так и CD8 Т-клеткам является важным шагом в формировании протективного иммунитета хозяина. Макрофаги, которые не активировались до проглатывания B. abortus, отличаются по ответной реакции на антиген по сравнению с ранее активированными макрофагами, которые значительно более эффективны в уничтожении бруцелл.^52,53 Brucella abortus, проглатываемые инактивированными макрофагами, могут ингибировать развитие фаголизосом или нейтрализовать кислую среду, что позволяет им избежать гибели и размножаться в клетке относительно незатронутыми.⁵² D этих неактивированных фагоцитах бруцеллы заставляют макрофаги подавлять их реакцию на сильный CD4 + Th1 имунный ответ. Активированные макрофаги разрушают B. abortus при проглатывании и фаголизосомном слиянии, поле чего бактерии могут быть распознаны и представлены корецеторам CD4+ Th1-клеток главного комплекса гистосовместимости класса II. Эффекторная CD4+ Th1-клетки секретирует интерферон (IFN)-γ, который дополнительно активирует макрофаги, вызывая увеличение противомикробной активности против патогена. Brucella abortus вызывает сильный CD8+ Т-клеточный ответ, который опосредует цитотоксическую активность для лизиса инфицированных клеток. Если макрофаг, содержащий реплицирующийся B. abortus, лизируется, бактерии высвобождаются во внеклеточную среду, где они могут либо заражать другие клетки, либо подвергаться воздействию иммунной системы, а также проглатываться и уничтожаться активированными макрофагами.^{27,53,55–57}

Вакцина

Разработка эффективных вакцин против бруцеллеза находится на передовой профилактики этого заболевания. Было проведено множество экспериментов с использованием инактивированных и живых культур возможных кандидатов на вакцину. Инактивированные кандидаты на вакцины обычно дают плохой иммунитет, в то время как живые вакцины вирулентных штаммов обычно обеспечивают хорошую защиту против абортов, но часто приводят к высвобождению патогенных микроорганизмов и возможному заражению восприимчивых животных инфекцией.⁵⁸ Вакцины против бруцеллы должны характеризоваться ослабленностью патогена, способностью индуцировать защитный клеточный иммунный ответ и стабильностью при многократных пассажах in vivo.^58–60 Идеальные качества кандидата на вакцину включают: 1) большую продолжительность защиты; 2) минимальное вмешательство в диагностические тесты; 3) простоту производства и хранения с повышенной стабильностью; и 4) минимальное неблагоприятное воздействие на вакцинированных животных без опасности для человека в случае воздействия.^59,61 Ни одна программа вакцинации не дает 100% эффекта, а вакцины против бруцеллеза не предотвращают заражение. Цель вакцинации против бруцеллеза - повысить иммунитет стада и предотвратить аборты и распространение возбудителя. Программы контроля многогранны и включают вакцинацию, надзор и управление стадом. Вакцинация против бруцеллеза крупного рогатого скота является мощным инструментом, используемым в программе ликвидации бруцеллеза в Соединенных Штатах. Первой вакциной против бруцеллеза, одобренной федеральным правительством, был штамм-19 (S19) гладкой формы B. abortus, который был внедрен в 1941 году.⁵⁸ После многих лет успешного использования конфликты с S19 возникли из-за его вмешательства в диагностические тесты, и в 1996 году Министерство сельского хозяйства США утвердило новую вакцину с шероховатой формой B. abortus RB51 (RB51) вместо S19 в качестве официальной вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота.⁶²