Воспроизводство крупного рогатого скота

Контроль качества спермы быков в центрах искусственного осеменения

Patrick Vincent¹ , Shelley L. Underwood¹ , Catherine Dolbec¹ , Nadine Bouchard¹ , Tom Kroetsch² и Patrick Blondin¹

• 1 L’Alliance Boviteq Inc., Сен-Иасент, Квебек, Канада

2 The Semex Alliance, Гуэлф, Онтарио, Канада

Вступление

Фертильность - это многофакторный феномен, который зависит от использования спермы достаточного качества и количества, точного времени и метода осеменения, а также правильного управления стадом. При использовании искусственного осеменения (ИО) в молочном животноводстве, необходимо управлять рядом этих факторов, включая определение охоты, время осеменения относительно охоты и правильное обращение с замороженным семенем. Но это также ответственность центров производства спермы (ЦПС), поставляющих соломики со сперматозоидами с хорошей жизнеспособностью, которые обеспечивают приемлемый уровень зачатия, учитывая, что все остальные параметры соблюдаются правильно. Чтобы обеспечить приемлемую фертильность после искусственного осеменения, после разморозки в каждой соломинке сперматозоиды должны присутствовать в достаточном количестве (концентрация) и обладать рядом характеристик, важных для оплодотворения. Соответственно, сперматозоиды должны пережить процедуру оттаивания с нормальной морфологией, неповрежденной акросомой, целостностью ДНК, активными митохондриями и поддерживать прямолинейно-поступательное движение, чтобы пересечь женский репродуктивный тракт. Некоторые из этих характеристик измеряются во время проверки качества семени после оттаивания, проводимых ЦПС перед реализацией. Контроль качества (QC) - это гарантия того, что каждая партия соломинок прошла анализ спермы на параметры, связанные с фертильностью.

Несмотря на то, что анализ спермы может показаться простым в выполнении, тщательное внимание к деталям и технике важно для получения точного и продуктивного анализа. Ручной анализ спермы с использованием светового микроскопа был стандартным методом в большинстве ЦПС. Однако, ручной анализ очень субъективен и подвержен ошибкам как у одного и того же специалиста, так и между специалистами. Точно так же использование флуоресцентной микроскопии для оценки акросомы, мембраны и целостности ДНК сперматозоидов заметно медленнее, ограничено из-за небольшого количества проверенных сперматозоидов в каждом образце и невозможности проведения обширного мультипараметрического анализа.

Чтобы сделать контроль качества максимально точным, ЦПС ужесточили требования к тестированию спермы, перейдя от занимающей много времени базовой субъективной оценки нескольких сотен сперматозоидов на предмет концентрации, подвижности и морфологии с помощью микроскопии к использованию компьютерного анализа для оценки подвижности и проточной цитометрии для анализа тысяч клеток в секунду на предмет таких характеристик, как жизнеспособность, митохондриальная активность, акросома, ДНК и капацитационный статус. Темами для обсуждения в этом обзоре являются различные инструменты и анализы, используемые в ЦПС для определения показателей качества (QC) спермы быков, факторы, которые следует учитывать при использовании этих инструментов, и то, как эффективность процедур QC может быть максимально использована для прогнозирования фертильности.

Объективная оценка подвижности спермы

Компьютерный анализ спермы (CASA) является мощным инструментом объективной оценки подвижности сперматозоидов и поэтому в настоящее время часто используется для оценки ее качества. Основные компоненты этой технологии состоят из микроскопа для визуализации образца, цифровой камеры для захвата изображений и компьютера со специализированным программным обеспечением для анализа движения сперматозоидов. Главный принцип, лежащий в основе большинства систем CASA, основанных на микроскопии, заключается в получении с помощью компьютерных программных алгоритмов серии последовательных изображений подвижных сперматозоидов в статическом поле зрения, которые затем сканируются, чтобы идентифицировать отдельные сперматозоиды и отслеживать их траекторию в поле зрения. Технология также включает в себя распознавание одной и той же клетки в каждом изображении по ее положению и определение ее следующего положения путем оценки вероятности того, что она переместится только на определенное максимальное расстояние между кадрами.

Кроме того CASA может предоставить информацию о концентрации сперматозоидов, морфологии, жизнеспособности и индексе фрагментации ДНК сперматозоидов после разморозки. Однако, эти более специализированные методы обычно не применяются для рутинного анализа замороженной-размороженной спермы в ЦПС.

С помощью CASA некоторые параметры подвижности, заключающихся в описании специфических движений сперматозоидов, можно проанализировать более детально, чем при субъективной оценке. Эти компьютеризированные измерения могут быть полезны для одновременной и объективной оценки различных характеристик сперматозоидов и ценны для обнаружения незначительных изменений в движении сперматозоидов, которые не могут быть идентифицированы с помощью обычного субъективного анализа спермы.^1–3 Параметры, обычно исследуемые с использованием систем CASA, - это подвижность, скорость движения, прямолинейность и боковое смещение сперматозоидов по мере их продвижения по своим траекториям в образце. Процентное соотношение общего числа подвижных клеток к числу клеток с прямолинейно-поступательным движением - наиболее важные параметры подвижности при оценке сперматозоидов. Показатель общей подвижности включает сперматозоиды, которые демонстрируют любой тип движения, в то время как прогрессивно подвижные сперматозоиды движутся вперед по прямой линии. Сперматозоиды, которые перемещаются ненормальным образом, например, кружатся по узкому кругу, не входят в состав прогрессивно подвижных сперматозоидов. Помимо оценки подвижности сперматозоидов, компьютер вычисляет кинетические значения каждого сперматозоида, которые включают скорость движения, ширину траектории головки сперматозоида и частоту изменения направления головки сперматозоида. CASA определяет следующие значения скорости: криволинейная скорость, прямолинейная скорость и средняя скорость движения.² Амплитуда бокового смещения головки и частота "биения" головки - это две другие характеристики, измеренные с помощью инструментов CASA.²

Ограничения технологии CASA

Несмотря на способность CASA к объективной оценке, эта технология имеет свои ограничения. Известно, что на результаты CASA влияет ряд факторов. Тип камеры для образцов, используемой при анализе, может влиять на движение сперматозоидов, точность подсчета количества клеток и, следовательно, процент подвижных сперматозоидов.⁴ Температура, при которой анализируется сперма, также является важным фактором, который может искажать результаты CASA. Так, независимые исследования показали, что анализ спермы при температуре ниже 37°C значительно повлиял на результаты.^5,6 В них процедуру CASA на сперматозоидах провели при поддержании 37 °C с помощью подогревателя, и сравнили результаты со сперматозоидами, проанализированными при комнатной температуре или при 30°C. Данные продемонстрировали снижение параметров подвижности (процент подвижных сперматозоидов и скорость движения) у сперматозоидов анализируемых при менее 37° C. Эти эксперименты предполагают, что простое изменение, введенное в анализ подвижности сперматозоидов, может существенно повлиять на результаты. Концентрация, при которой анализируется сперма, тоже является важным аспектом, влияющим на результаты CASA. Было установлено, что при низких концентрациях спермы (<20 миллионов/мл) может произойти переоценка концентрации и, следовательно, недооценка процента подвижных клеток из-за накопления несперматических частиц (дебриса).

С другой стороны, при более высоких концентрациях (>50 миллионов/мл) большая часть быстро движущихся клеток будет исключена из анализа из-за столкновений клеток, выхода сперматозоидов из области анализа или исключена на основании искажений, вызванных их тесным расположением, приводящих к недооценке моторики.^5,7 Условия отбора проб являются источником ошибки при получении данных с помощью CASA. Компьютерное и видео-оборудование постоянно развивается, и различные системы CASA используют различные модели видеокамер. Большинство систем CASA допускают частоту кадров 30 или 60 Гц для анализа следов и скорости сперматозоидов. Исследования показали важность частоты кадров для достоверности анализа.^8–10 Принято считать, что требуется более высокая частота кадров, чтобы как можно точнее оценить путь следования быстро нелинейно движущихся сперматозоидов. Для изучения гиперактивных сперматозоидов Mortimer и Swan¹¹ предложили использовать самую высокую частоту кадров, доступную в системе, чтобы получить наиболее точную оценку.

Тип разбавителя для спермы, - еще один аспект, который следует учитывать при оценке сперматозоидов с помощью CASA. Некоторые разбавители содержат частицы размером с головку сперматозоида, поэтому программное обеспечение CASA включает их в анализ. Разбавители на основе яичного желтка и молока являются примерами наполнителей, содержащих такие частицы. Кроме того, при наблюдении за спермой, разбавленной молочным разбавителем, жировые шарики маскируют сперматозоиды, что делает невозможным анализ CASA. Чтобы провести анализ подвижности в этих условиях, образцы можно промыть, чтобы удалить остатки разбавителя из спермы. Однако, было установлено, что промывание спермы влияет на подвижность сперматозоидов¹² , что затрудняет правильную оценку. Чтобы решить эту проблему, применяют технологию флуоресценции, позволяющую отличать сперматозоиды от других частиц в разбавителе путем окрашивания головок сперматозоидов ДНК-связывающим флуорохромом. При флуоресцентном освещении программное обеспечение CASA обнаруживает только объекты, содержащие ДНК, что исключает необходимость промывки. Этот метод повышает точность определения концентрации¹³ , а также анализа подвижности¹⁴ спермы, разведенной в этих разбавителях. Следовательно, стандартизация типа камеры, температуры, концентрации и типа разбавителя имеет решающее значение для обеспечения стабильно точного контроля качества на ЦПС.

Подвижность - одна из наиболее важных характеристик, связанных с оплодотворяющей способностью сперматозоидов. Несколько групп ученых сообщили о значительной корреляции между общим^15–18 и прогрессивным (прямолинейно-поступательным)¹⁹ движением сперматозоидов быков и связанной с ним фертильностью. Однако, другие исследователи сообщили, что субъективный анализ подвижности спермы не коррелировал с фертильностью.^20,21 С помощью CASA собирают широкий спектр параметров подвижности сперматозоидов, что позволяет более детально и точно анализировать движения сперматозоидов и отслеживать их скорость. Исследователи также попытались сопоставить кинетические параметры с фактической фертильностью спермы, при этом некоторые группы смогли показать положительную корреляцию между скоростью прямолинейного движения сперматозоидов и их фертильностью.^18–22 В другом исследовании использовалась комбинация нескольких параметров подвижности для достижения очень высокой корреляции с фертильностью быков.

В совокупности эти исследования показывают высокий потенциал CASA для оценки качества спермы и, следовательно, ее использования в качестве мощного инструмента для измерения характеристик спермы и прогнозирования фертильности быков по сравнению со стандартной оценкой. Однако, как упоминалось выше, стандартизация условий и параметров всех тестов CASA является ключом к получению устойчивых и достоверных корреляций с фертильностью.

В настоящее время доступно несколько моделей инструментов CASA для оценки качества и подвижности сперматозоидов. Каждая система работает по схожим принципам, но они различаются настройками параметров и используют разные алгоритмы для определения скорости и траекторий. Настройки параметров, пороговые значения, частота кадров видео и другие переменные будут влиять на результаты CASA, как было рассмотрено Дэвисом и Кацем.²³ Как упоминалось выше, новые технологии и программное обеспечение CASA быстро развиваются. Наша лаборатория провела небольшое исследование, измерив способности CEROS (Hamilton-Thorne, США) и анализатора класса сперматозоидов (SCA; Microptics, Испания) к оценке подвижности и концентрации размороженных бычьих сперматозоидов в яичном разбавителе (неопубликованные данные). В общей сложности с помощью обеих систем было проанализировано 18 разных замороженно-размороженных эякулятов, и были сравнены средние проценты общей и прогрессивной подвижности, концентрация, средняя скорость движения, криволинейная скорость, прямолинейная скорость, поперечная частота биений и амплитуда бокового смещения головки (Рисунок 74.1). Среди всех проанализированных параметров только процент от общего количества подвижных клеток почти не отличался между системами. Расхождения можно объяснить лучшей способностью SCA исключать частицы яичного желтка из анализа. SCA распознал несперматические частицы по размеру в микронах, в то время как CEROS использовал пиксели для оценки размера клеток. Различия в алгоритмах, используемых для подсчета медленных, средних и быстрых сперматозоидов, также могут объяснить различия в подвижности и кинетических параметрах, наблюдаемые между каждой системой. В целом, это мини-исследование указывает на высокую вариабельность между системами CEROS и SCA при оценке параметров подвижности сперматозоидов.

Анализ функции спермы методом проточной цитометрии

Проточная цитометрия анализирует клетки, взвешенные в потоке жидкости, проходящей с высокой скоростью перед одним или несколькими лазерами. Свет, излучаемый связанными с флуорохромом клетками, улавливается фотоумножителями и преобразуется в электронный сигнал, который затем переводится в цифровую форму с помощью программного обеспечения. Ключевыми особенностями проточной цитометрии являются сбор и анализ тысяч клеток за секунды и мультипараметрический потенциал технологии. Самые современные цитометры обычно оснащены тремя лазерами и не менее 10 фотоумножителями, что позволяет метить клетки одновременно несколькими зондами и, таким образом, анализировать множество параметров одновременно. В последние несколько лет многопараметрический аспект проточной цитометрии позволил этой технологии стать популярным инструментом для оценки свойств сперматозоидов.^24–26 Был разработан широкий спектр флуорохромов для оценки многочисленных характеристик сперматозоидов. Здесь мы рассмотрим некоторые флуорохромы, используемые для изучения сперматозоидов с помощью проточной цитометрии.

Характеристики сперматозоидов, анализируемые с помощью проточной цитометрии

Жизнеспособность / смертность

Йодид пропидия - самый популярный краситель, используемый для идентификации мертвых клеток. Этот флуорохром способен проникать в сперматозоиды с поврежденными клеточными мембранами и связываться с ДНК, где его можно возбудить с помощью 488-нм лазера, присутствующего в большинстве цитометров.^27–29

Йодид пропидия часто используется в сочетании с SYBR-14, другим ДНК-метящим зондом.^30,31 SYBR-14 также возбуждается 488-нм лазером и представляет собой проникающий зонд, окрашивающий все клетки. Одновременно добавленный к клеткам йодид пропидия замещает или гасит флуоресценцию SYBR-14 в поврежденных клетках. Также для оценки жизнеспособности клеток теперь доступен новый фиксируемый краситель, выпускаемый Invitrogen под названием Live/Dead® - набор для фиксации мертвых клеток.³² Этот краситель вступает в реакцию с аминами на поверхности жизнеспособных клеток или внутри цитоплазмы клеток с поврежденными мембранами. Окрашивание аминов на поверхности жизнеспособных клеток приведет к относительно тусклому окрашиванию по сравнению с ярким окрашиванием мертвых клеток. Этот фиксируемый краситель принадлежит к крупному семейству, способен к возбуждению/ излучению различными длинами волн, что позволяет использовать его в большинстве цитометров.

Целостность акросомы

Оценка акросомного статуса в основном проводится с использованием растительных лектинов, распознающих акросомные лиганды. Агглютинин гороха (Pisum sativum) связывает маннозные и галактозные фрагменты акросомного матрикса. Поскольку агглютинин Pisum sativum не может проникнуть через неповрежденную акросомную мембрану, будут окрашены только сперматозоиды с прореагировавшей или поврежденной акросомой.^21,33,34 Однако, было показано, что этот агглютинин имеет сродство (аффинность, как, например антиген с антителом) к яичному желтку и неспецифическим сайтам связывания на поверхности сперматозоидов.^35,36 Этот аспект может стать проблемой при анализе спермы, замороженной в разбавителе на основе яичного желтка, и привести к неправильной интерпретации акросомного статуса сперматозоидов. Агглютинин Arachis hypogaea (арахис) связывает галактозные фрагменты внешней мембраны акросомы и является наиболее популярным лектином, используемым для изучения целостности акросомной мембраны с помощью проточной цитометрии.^37–39 Кроме того, агглютинин Arachis hypogaea кажется наиболее надежным зондом для идентификации сперматозоидов с поврежденной акросомой, поскольку он в меньшей степени связывается с другими участками сперматозоидов.⁴⁰ Агглютинин Pisum sativum и агглютинин Arachis hypogaea обычно маркируются флуорохромами FITC, что позволяет использовать их во всех цитометрах.

Митохондриальная активность

Митохондрии - очень важные органеллы, участвующие в первую очередь в генерации энергетических субстратов для подвижности сперматозоидов. Родамин 123 был одним из первых зондов для мониторинга митохондриальной активности.^41,42 Родамин 123 изолируется в активных митохондриях и вымывается из клетки при потере мембранного потенциала. Эта характеристика ограничивает его использование, когда требуется количественная оценка или когда требуется фиксация сперматозоидов. Решением проблемы с фиксацией может стать краситель Mitotracker®. Этот краситель накапливается и окрашивает активные митохондрии и имеет преимущество в том, что он способен возбуждать и излучать флуоресценцию в различных диапазонах.^42–44 Самым популярным зондом для оценки митохондриальной активности является JC-1 (5,5', 6,6'-тетрахлор-1,1', 3,3' тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид).^45–47 В сперматозоидах, содержащих митохондрии с высоким мембранным потенциалом, JC-1 проникает в матрикс митохондрий, где он накапливается, образует J- агрегаты и приобретает флуоресцентный красный цвет. В сперматозоидах, содержащих митохондрии с низким мембранным потенциалом, JC-1 не может накапливаться в митохондриях и остается в цитоплазме в зеленой флуоресцентной мономерной форме.