Глава 76
Сбор и пересадка эмбрионов
Эдвин Г. Робертсон
Harrogate Genetics International, Харрогейт, Теннесси, США
Вступление
Подобно тому, как слоган Burger King «Have It Your Way» (Сделай по-своему) применим к фаст-фуду, опытный практикующий специалист по сбору эмбрионов также скажет, что он применим к технике сбора эмбрионов крупного рогатого скота. С тех пор, как доктора Robert Rowe, Peter Elsden и Martin Drost сообщили об успешном нехирургическом заборе эмбрионов крупного рогатого скота в 1976 году, перенос эмбрионов стал обычной практикой в животноводстве. После посещения доктора Rowe в сентябре 1977 года в Миддлтоне, штат Висконсин, для наблюдения за его техникой, за последующие 36 лет я собрал более 180 000 эмбрионов от 30 000 коров и пересадил более 80 000 эмбрионов. За это время мои техники эволюционировали. Обучая новичков и посещая других практиков, чтобы наблюдать за их техниками, я быстро понял, что «мой путь» не был «единственным путем». Выбор процедуры, удобной для ваших рук, приведет к уверенности, которая приведет к тому, что вы станете успешным практикующим специалистом по переносу эмбрионов.
Я наблюдал за методами переноса эмбрионов по всему миру и могу честно сказать, что многие методы можно использовать для успешного сбора и пересадки. Однако, я предпочитаю «простой», «легкий» и «быстрый», поэтому на протяжении всей своей карьеры я всегда искал методы, которые ограничивают мою подверженность ошибкам, а также те, которые экономят время. Итак, техники, которые я опишу, - это «мой путь», самые эффективные и действенные техники в моих руках. Надеюсь, вы почерпнете несколько полезных идей, которые повысят ваши навыки и производительность.
В предыдущих главах обсуждалась суперовуляция, место оплодотворения и транспортировка спермы вверх по яйцеводу и эмбриона / яйцеклетки вниз по яйцеводу в матку. Мы начнем наше обсуждение, предполагая, что эмбрионы попали в матку к 4.5 или 5.0 дню.
Тайминг
Поскольку эмбрионы наиболее универсальны на 6-7 день, большинство практикующих врачей планируют сбор через 6,5-7 дней после того, как у донора впервые зафиксируют рефлекс неподвижности.
Когда сбор должен быть произведен у нескольких доноров в один и тот же день, обычно разница в наступлении стоячей охоты между ними составляет не менее 12-24 часов. Так как эмбрионы могут вылупиться к 7,5–8,0 дням и стать менее пригодными для использования, обычно целесообразно сначала собрать доноров, у которых проявился стоячий жар раньше всего. Также помните, что сбор на 6-й день или ранее может привести к тому, что эмбрионы будут слишком незрелыми, чтобы очень хорошо выдержать процесс замораживания.
Среды для сбора эмбрионов
Сегодня доступны многие готовые коммерческие среды для сбора эмбрионов. Я использую готовую к применению среду Vigro Complete Flush™ компании Bioniche, содержащую поверхностно-активное вещество (поливиниловый спирт) и антибиотики (гентамицин и канамицин). Некоторые специалисты используют имеющийся в их ветеринарных клиниках раствор Рингера с лактатом и просто добавляют 0.1% бычьего сывороточного альбумина в качестве поверхностно-активного вещества. При кратковременном хранении это, по-видимому, хорошо работает и обходится значительно дешевле.
Если эмбрионы собирают для экспорта, в некоторых странах запрещено добавлять продукты животного происхождения, такие как бычий сывороточный альбумин (из-за опасений, связанных с губчатой энцефалопатией крупного рогатого скота, или BSE). В таких случаях допустимо использовать готовую среду, в которой поверхностно-активным веществом служит поливиниловый спирт.
Подготовка доноров
В первые годы работы я возил с собой на фермы наклонную платформу и устанавливал её в станке либо просил владельца скота приподнять переднюю часть станка на 30–35 cm. Приподнятое положение смещает внутренние органы назад и способствует подъёму матки, облегчая доступ к ней для манипуляций. Кроме того, на собственном горьком опыте я усвоил урок относительно лишения доноров и реципиентов корма. Хотя идея сократить потребление корма до моего приезда, чтобы уменьшить количество каловых масс, казалась разумной, я быстро понял, что один из лучших помощников специалиста по пересадке эмбрионов — наполненный рубец. Наполненный рубец не только приподнимает матку и смещает её каудально, но и предотвращает отрицательное давление в брюшной полости, возникающее при пустом рубце. Из-за отрицательного давления в брюшной полости воздух
засасывается вдоль руки в прямую и ободочную кишку во время промывания, что сильно затрудняет манипуляции с маткой. Наклонная платформа и корм — два больших помощника.
После того как донор оказывается в станке или стойле с фиксацией, проводят эпидуральную анестезию лидокаином (3–5 mL), используя иглу 3.75 cm × 18-го калибра. На мой взгляд, подготовка к эпидуральной анестезии не требуется. Стрижка или мытьё шерсти мало что дают, если не проводить хирургическую подготовку области корня хвоста. Я никогда не провожу никакой подготовки к эпидуральной анестезии ни у доноров, ни у реципиентов. Сразу после неё я пальпирую каждый яичник и записываю предполагаемое число жёлтых тел на каждом из них. Также отмечаю неовулировавшие фолликулы и размеры яичников, если они необычны. Эти сведения полезны после получения результатов — как хороших, так и плохих.
Седацию одни считают помощником, другие — помехой. Чаще всего непосредственно перед эпидуральной анестезией я подкожно или внутримышечно ввожу 10 mg (0.1 mL) препарата Rompun (ксилазин). Хотя он немного повышает тонус матки, я никогда не считал это проблемой. Я собирал эмбрионы у многих коров и без ксилазина, но предпочитаю его применять: он успокаивает возбудимых коров и облегчает мне работу, поскольку они стоят спокойно на протяжении всей процедуры сбора.
Я никогда не применяю дезинфицирующие средства (они здесь враги) рядом с материалами для сбора эмбрионов. После того как хвост подвязан в сторону, я просто протираю область промежности. Если воды нет, я просто начисто протираю эту область одноразовым полотенцем. После такой подготовки корова готова к сбору эмбрионов.
Оборудование (и поставщик)
-
Катетер: силиконовый, 52 cm, размер 16 по французской шкале, с манжетой 5-mL (Bioniche).
-
Стилет: из нержавеющей стали, 60 cm (Bioniche).
-
Y-образная трубка: пластиковая, 150 cm; один конец снабжён наконечником для шприца, другой присоединяется к фильтру EZ Flow (Pets-inc).
-
Одноразовый пластиковый трёхходовой кран (Pets-inc).
-
Герметичный шприц объёмом 50 или 60 mL (Pets-inc).
-
Фильтр для эмбрионов EZ Flow (Pets-inc).
-
Гель KY (без спермицидных компонентов).
-
Расширитель шейки матки: инструмент Harrogate AI/ET для искусственного осеменения и пересадки эмбрионов и расширения шейки матки (Stone Mfg. Co.).
-
Среда: Vigro Complete (Bioniche).
-
Шприц объёмом 10-mL для раздувания манжеты.
Стерилизация
Большинство оборудования стерилизует изготовитель гамма-излучением. Много лет назад выяснилось, что оксид этилена токсичен для эмбрионов, и его больше не используют. Если катетеры и трубки нельзя автоклавировать, достаточно просто вымыть их лабораторным моющим средством Alconox™ и несколько раз ополоснуть дистиллированной водой. Многие специалисты выбрасывают всё оборудование после однократного использования. Я повторно использую всё, что возможно, с учётом стоимости.
Сбор эмбрионов
Выбор катетера зависит от того, какую часть матки промывают (рог или тело), а также от возраста и размера коровы. На протяжении многих лет я использовал стандартный латексный катетер Фолея для людей длиной 45 cm и размером 16 или
18 по французской шкале для промывания матки у коров любого размера. Сегодня у нас есть широкий выбор средств, делающих сбор эмбрионов проще и удобнее. Сейчас для всех промываний я использую силиконовый катетер длиной 52 cm, размером 16 или 18 по французской шкале, с баллоном 5-mL (Bioniche). Баллон 5-mL при необходимости можно раздуть до 20 mL; при этом он принимает более округлую и чётко очерченную форму, чем баллон 30-mL, который при раздувании становится более вытянутым (рисунок 76.1).
Установка катетера — первый критически важный этап нехирургического сбора эмбрионов. Я опишу установку катетера и процедуру сбора как при промывании одного рога, так и при промывании тела матки (рисунок 76.2). Необходимо учитывать следующее. Донор — тёлка, которая ещё не телилась, или корова? Если тёлка, насколько развиты её половые органы? Здоровы ли половые органы донора или имеются отклонения? Если отклонения есть (напримерg, спайки, деформации, инфекция; также следует учитывать породу и возраст), каковы они и как могут повлиять на сбор? Каков темперамент донора? Какие условия имеются для промывания?
Сначала поговорим об обычной процедуре сбора, а затем обсудим особые обстоятельства, отклонения и профессиональные приёмы. Эксперты учат банковских кассиров выявлять фальшивые деньги, сначала показывая им, как выглядят настоящие: тогда они могут заметить любое отклонение. Именно так я предпочитаю подходить к сложным случаям сбора эмбрионов. Когда вы научитесь эффективно и уверенно работать с обычными коровами, при возникновении трудностей вы, надеюсь, не запаникуете, а грамотно справитесь с ними и успешно завершите сложную процедуру сбора.
Чтобы катетер стал достаточно жёстким для проведения через шейку матки, в него необходимо вставить металлический стилет. Перед введением стилета в катетер на его кончик наносят небольшое количество геля KY, чтобы облегчить извлечение стилета после проведения катетера. Стилет должен быть немного длиннее катетера (стилет 60-cm, катетер 52-cm), чтобы катетер можно было натянуть и стилет плотно прилегал к его внутренним стенкам (рисунок 76.3). Это не позволяет кончику стилета случайно выйти через одно из отверстий для жидкости рядом с кончиком катетера при проведении через шейку матки. Повреждение шейки матки и маточное кровотечение — наши враги. Катетер проводят примерно так же, как при искусственном осеменении (AI), но катетер значительно толще. Кроме того, катетер необходимо удерживать натянутым: иначе давление пальцев на шейку матки может вытолкнуть кончик стилета из просвета через боковое отверстие у кончика катетера.
Рано или поздно каждому специалисту встречается искривлённая шейка матки, через которую не удаётся провести катетер. Незаменимый инструмент в таком случае — расширитель шейки матки. Я никогда не отправляюсь на выезд без него, хотя использую его, возможно, лишь раз или два в год. Компания Stone Mfg. Co. изготовила расширитель по моей разработке и продаёт его как инструмент Harrogate AI/ET для искусственного осеменения и пересадки эмбрионов и расширения шейки матки. (Примечание редактора : Изделие № 10050, Stone Mfg, 1212 Kansas Ave, Канзас-Сити, Миссури 64127. inquiries@ stonemfg.net.) Расширитель можно провести даже через шейку матки с самым трудным доступом. Затем, пока ассистент извлекает расширитель, можно быстро провести катетер, прежде чем шейка матки успеет вернуться к своей аномальной форме. Расширители особенно полезны при работе с животными породы браман и её помесями: с возрастом у них нередко появляются S-образные изгибы и/или изгибы шейки матки под углом 90° (рисунок 76.4).
Проведение катетера через труднопроходимую или искривлённую шейку матки требует упорства. На стилет необходимо постоянно надавливать в направлении вперёд. Сдавливая каждую складку шейки матки перед
Удлинённый
30 ml
Компактный
5 ml
Катетер
Y-образная трубка
Среда Vigro
Герметичный шприц объёмом 50 куб. см
Шприц для подачи жидкости
Зажим
Отводящий трёхходовой клапан
Фильтрующий диск EZ Flow для поиска эмбрионов
Рисунок 76.3Стилет, выступающий из катетера.
Катетер часто помогает, «сплющивая» кольцо и превращая его отверстие в «широкую щель», которая может быть смещена в ту или другую сторону. Четыре кольца шейки матки обычно расположены так, что отверстие каждого находится прямо напротив отверстия предыдущего, но нередко отверстие одного кольца находится по центру, следующего — в положении 9 часов, ещё одного — в положении 3 часов, а последнего — в положении 12 часов. Превращение отверстий в щели путём надавливания часто облегчает прохождение катетера. Расширители помогают определить расположение каждого «отверстия».
Промывание тела матки
В течение первых 5 лет я всегда промывал каждый рог матки отдельно. В последние 30 лет я применяю промывание тела матки, кроме случаев, когда по диагностическим причинам нужно собрать материал из отдельных рогов или получить один эмбрион. Чтобы промывать тело матки без затруднений, необходимо понимать его анатомию (рисунок 76.5).
В ветеринарном институте меня учили ориентироваться на наружное раздвоение матки при её манипуляции. В зависимости от возраста, породы и размера коровы наружное раздвоение может находиться на расстоянии 5–15 cm от зева шейки матки. Из-за этого может казаться, что непосредственно перед зевом шейки в теле матки имеется много свободного пространства. Но это не так! В действительности свободное пространство составляет всего 1.25–5 cm (у тёлок обычно 1.25–1.9 cm, а у более крупных взрослых коров — 2.5–5 cm). Поскольку кончик катетера выступает перед баллоном манжеты на 2.5–3.75 cm, при наполнении манжеты кончик катетера входит в один
