Воспроизводство крупного рогатого скота

Глава 32

Искусственное осеменение

Ram Kasimanickam

Отделение ветеринарных клинических наук, Колледж ветеринарной медицины, Университет штата Вашингтон, Пуллман, Вашингтон, США

Вступление

Искусственное осеменение (ИО) - введение сперматозоидов в репродуктивный тракт самки с помощью инструмента - является самой старой вспомогательной репродуктивной технологией.¹ Использование ИО в репродукции домашних животных было впервые внедрено по санитарным причинам. Однако, как только замороженная сперма стала легко доступной, экономические преимущества улучшения фертильности и ускоренного генетического прогресса стали очевидными. С тех пор ИО стало основным методом быстрого распространения предпочтительных генетических признаков животных. Многочисленные быки произвели сотни тысяч доз семени и потомства. Кроме того, уменьшенное количество сперматозоидов на дозу осеменения без ущерба для фертильности значительно увеличило количество осеменений и потомков от генетически превосходных производителей. Несколько важных разработок, включая новые разбавители спермы, новые методы искусственного осеменения, протоколы синхронизации охоты и овуляции, а также семя, разделенное по полу, еще больше увеличили масштаб использования и важность искусственного осеменения в качестве вспомогательной репродуктивной технологии.

Достижение высокой фертильности при искусственном осеменении требует превосходного управления всеми фазами программы ИО; это действительно требует командного подхода. В связи с этим персонал, отвечающий за сбор, обработку и доставку спермы, должен правильно выполнять свои задачи, поскольку любой дефицит приведет к снижению плодовитости. Кроме того, врожденная фертильность быков и коров также имеет жизненно важное значение.

Крупные коммерческие центры искусственного осеменения, как правило, имеют протоколы и процедуры контроля качества для обеспечения сбыта спермы хорошего качества. Однако, после продажи спермы фертильность зависит от способности других людей правильно обрабатывать и оттаивать сперму и правильно осеменять коров в нужное время. Основной целью обработки спермы является сохранение оплодотворяющей способности, что достигается путем минимизации воздействия вредных факторов на сперматозоиды. Повреждение спермы во время криоконсервации, хранения и оттаивания объясняется температурным шоком, образованием ледяных кристаллов, окислительным стрессом, мембранными изменениями, криопротекторной токсичностью и осмотическими изменениями.²

Знание техники обращения с сосудом для хранения семени, правильной технологии оттаивания и обращения со спермой, а также соблюдение гигиены, места введения семени и времени ИО являются критическими точками и должны периодически пересматриваться.

Обращение с сосудом Дьюара

Замороженная сперма хранится в специализированном резервуаре с жидким азотом. Эти резервуары имеют прочный внешний кожух (алюминий или нержавеющая сталь) и внутренний отсек, в котором находится жидкий азот. Пространство между внутренней и наружной оболочками изолировано и находится под вакуумом. Крышка в виде цилиндра из плотной пены закрывает горловину сосуда для изоляции жидкого азота и замороженной спермы от внешних температур, тем самым сводя к минимуму испарение азота. Тем не менее, сосуд не герметичен; жидкий азот превращается в газ при колебаниях температуры (если сосуд плотно закрыт, он может взорваться). Последние технические достижения в проектировании и конструировании привели к созданию удобных в использовании резервуаров для сохранения хорошего качества спермы, в том числе с увеличенными интервалами хранения (6–12 месяцев). Следует отметить, что интервалы хранения зависят от модели сосуда и кратности его использования ( открывания ). Важно, чтобы уровень азота регулярно контролировался и азот добавлялся по мере необходимости.

Благодаря новым сосудам для спермы поддержание с помощью жидкого азота очень низких температур во внутренней камере возможно благодаря высококачественному твердому изоляционному материалу и вакууму. Несмотря на это, все сосуды подвержены повреждениям в результате неправильного обращения. Внутренняя камера, содержащая жидкий азот, фактически подвешена к наружному корпусу с помощью горловины. Следовательно, любое ненормальное напряжение в трубке горловины, вызванное значительным усилием или чрезмерным колебательным движением, может привести к растрескиванию трубки, что приведет к потере вакуума. Прокол внешней оболочки также приведет к потере вакуума. Следует избегать сварки наружного корпуса, так как это также может привести к потере вакуума. Поскольку вакуум является основным изолирующим компонентом резервуара, его потеря вызывает повышение температуры во внутренней камере и быстрое испарение азота.

Накопление изморози в верхней части резервуара указывает на быстрое испарение жидкого азота и выход сосуда из строя. Хотя сперму можно хранить при –196 ° C в течение неопределенного времени с минимальным содержанием жидкого азота, следует все же соблюдать минимальную глубину 5 см.

Сосуды для хранения спермы следует держать вдали от прямых солнечных лучей в прохладном, чистом, сухом, не пыльном и хорошо проветриваемом помещении. Резервуары следует установить на деревянном поддоне и никогда не хранить непосредственно на бетонном полу (чтобы предотвратить коррозию на дне сосуда). Кроме того, сосуды нельзя складывать друг на друга. Сосуды следует размещать в месте, где их можно часто видеть, чтобы обнаружить чрезмерное испарение жидкого азота. Резервуар нельзя укладывать горизонтально и катить. Хранение сосуда на деревянной или пластиковой тележке с колесами облегчает его перемещение. Сосуды должны быть надлежащим образом закреплены во время транспортировки в транспортном средстве, чтобы минимизировать вероятность повреждения или утечки.

Хранение замороженной спермы

Большая часть спермы упакована в соломинки по 0,25 или 0,5 мл (отсортированная по полу сперма всегда выпускается в соломинках по 0,25 мл). Соломину помещают в стаканчик с четырьмя другими соломками от того же быка. Два стаканчика помещают в металлическую трость, на которой напечатан код быка. Трости хранятся в канистрах в сосуде для спермы. Хранение и обработка соломинок объемом 0,5 и 0,25 мл аналогичны.

Поддержание низких температур является залогом успешного хранения замороженной спермы. Во время охлаждения и замораживания в соломинке со спермой создаются микросреды. Каждый химический компонент незамороженной спермы замерзает или затвердевает при различной температуре. Вода начинает замерзать при понижении температуры ниже 0 ° C, образуя ледяные кристаллы, которые остаются несколько нестабильными при температурах выше –80°C. Считается, что эта нестабильность вызвана рекристаллизацией льда. Кроме того, когда вода превращается в лед, сперма подвергается воздействию оставшегося концентрированного раствора солей и других компонентов наполнителя, которые замерзают при температурах, значительно ниже точки замерзания воды. Нестабильность льда и концентрированных растворов вредны для спермы. Обезвоживание во время криоконсервации оказывает важное влияние на сперму; обезвоживание снижает риск образования внутриклеточных кристаллов льда, но чрезмерное обезвоживание так же вредно.^2,4 Регулирование осмоляльности разбавителей имеет решающее значение, так как она влияет на распределение воды во время криоконсервации.^2,4 К счастью, криопротекторы и оптимизированные программы замораживания помогают минимизировать повреждение сперматозоидов. Тем не менее, сперма должна храниться в условиях значительно ниже критических температур, когда начинает происходить рекристаллизация льда (от – 100 до –80 ° C). Температура опасно колеблется от нижней до верхней трети горловины резервуара³ (таблица 32.1). Кроме того, хранящаяся сперма может подвергаться воздействию неблагоприятных высоких температур при изъятии из сосуда Дьюара для размораживания, при перемещении семени из сосуда в сосуд и при обращении со спермой в горловине при попытке обнаружить и разморозить определенную соломинку. При этом другие соломинки для спермы в стаканах и канистрах также подвергаются воздействию высоких температур. Термальная реакция спермы в пайете объемом 0,5 мл при подъёме на 5 см от верхней части резервуара (при воздействии температуры –22 ° C) и 2,5 см (при воздействии 5 ° C) показана в таблице 32.2.³

Таблица 32.1 Колебание температуры в горловине стандартного сосуда для хранения спермы.

Источник : адаптировано из Saacke R, Lineweaver J, Aalseth E. Процедуры обработки замороженной спермы. В кн: Материалы 12-й конференции по ИО мясного скота NААВ, 1997, с. 49.

Таблица 32.2 Термальная реакция спермы (французская соломка объемом 0,5 мл), выдерживаемой при 5 и –22 ° C (температура, наблюдаемая в верхней части резервуара для хранения спермы).

Источник : адаптировано из Saacke R, Lineweaver J, Aalseth E. Процедуры обработки замороженной спермы. В кн: Материалы 12-й конференции по ИО мясного скота NAAB , 1997, p. 49.

Время достижения критической температуры, при которой происходит рекристаллизация льда (от –100 до –80 ° C) составляет примерно 10–20 с для обеих температур. Термическое повреждение спермы является необратимым и не может быть исправлено путем возврата спермы в жидкий азот. Чтобы обеспечить поддержание жизнеспособности сперматозоидов, трости и канистры должны быть подняты в горловину сосуда и находиться ниже линии замерзания не более 5–8 с. Если не удалось достать нужную соломинку в течение этого времени, канистру следует опустить обратно в сосуд для охлаждения, а затем вернуть в горловину.

Количество сперматозоидов на пайету является переменным, с некоторым уменьшением количества для высоковостребованных элитных быков и значительно меньшим количеством для семени, разделенного по полу. Более значительные разведения (2 миллиона сперматозоидов в соломинке 0,25 мл) не влияли на процент сперматозоидов с прямо поступательным движением, целостность или стабильность мембраны или целостность хроматина сразу после оттаивания по сравнению с малым разведением (15 миллионов сперматозоидов в соломинке 0,25 мл). Кроме того, не было различий в оплодотворяемости между этими уровнями разведения.⁵

Несмотря на это, хорошо известно, что некоторым быкам требуется больше сперматозоидов на дозу осеменения для поддержания фертильности. Кроме того, из-за очень низких количеств на дозу осеменения оплодотворяющая способность сортированной по полу спермы почти неизбежно снижается.

Рекомендации по минимизации риска теплового повреждения

• Разработайте систему инвентаризации спермы и установите ее на

• стене рядом с сосудом. Старайтесь держать сперму от каждого быка в отдельной таре. Маркируйте канистру и стаканы, указывая номер/ кличку быка. Эти меры предотвращают ненужный поиск и опасное воздействие на семя высоких температур в горловине сосуда.

• Организуйте быстрый перенос спермы из одного сосуда в другой.

• Вовлеките двух человек и расположите емкости рядом. Если возможно, заполните сосуды азотом перед переносом. Поднимайте канистры только до уровня, необходимого для обнаружения тары с семенем, подлежащем переносу.

• При подготовке к оттаиванию спермы поднимите канистру в

• нижнюю часть горловины, где можно захватить определенную трость, затем опустите канистру дальше в горловину. Удерживайте трость как можно ниже в горловине, защищая таким образом другие соломинки от термических повреждений. Если пайеты не могут быть легко извлечены, согните верхнюю петлю трости (угол 45 °), чтобы облегчить доступ.

• Используйте пинцет, чтобы извлечь соломинку и перенести ее в

• термостат для оттаивания. Как только соломинка будет извлечена, быстро опустите трость со спермой и канистру в корпус сосуда.

Способы оттаивания спермы

Существуют различные способы оттаивания спермы в пайетах, включая различную температуру в водяной бане и продолжительность оттаивания, карманное оттаивание, оттаивание на воздухе и оттаивание в корове.⁶ Независимо от того, какой метод выбран, всем сотрудникам на ферме рекомендуется использовать один и тот же метод размораживания спермы. Национальная ассоциация животноводов рекомендует погружать сперму в водяную баню при 30–35°C на 40 с. Время оттаивания для соломинок должно быть не менее 30 с.⁷ Размороженная сперма должна быть введена в корову в течение 15 минут после оттаивания, и следует избегать резкого снижения температуры после оттаивания.

При карманном оттаивании начальная температура в кармане составляла 30±1°C. Однако, через 1 мин после помещения в карман температура снизилась примерно до 19 ± 1°C, что может отрицательно повлиять на параметры семени. Сперма в пайете начала разжижаться примерно через 3 минуты после помещения в карман, а размораживание завершалось к 5 минутам.⁸ Результаты анализов жизнеспособности спермы после оттаивания в кармане сильно варьировали между экспериментами. Скорость оттаивания в кармане рубашки может варьироваться в зависимости от температуры окружающей среды и изоляционного эффекта различных типов ткани одежды и ее толщины. Кроме того, скорость оттаивания была намного ниже при карманном оттаивании по сравнению с водяной баней.⁸ Более быстрые скорости оттаивания приводят к более высокой жизнеспособности спермиев после разморозки по сравнению с методом карманного оттаивания.⁸ Однако, недавнее исследование показало, что несмотря на улучшение качества спермы in vitro при высокой скорости оттаивания эти показатели качества спермы не повышали фертильность in vivo по сравнению с методом карманного оттаивания.⁹

В коммерческих условиях используемый метод оттаивания, будь то карман или тёплая вода, не должен влиять на оплодотворяемость.⁹ Хотя некоторые комбинации наполнителя (цитрата и яичного желтка по сравнению с не нагретым разбавителем из цельного молока) кажутся терпимыми к процедурам оттаивания, другие комбинации более чувствительны, что приводит к снижению выживаемости сперматозоидов после оттаивания, оплодотворяемости или того и другого в зависимости от метода разморозки.¹⁰

Одновременное оттаивание нескольких соломинок спермы может способствовать эффективному осеменению большого количества коров без ущерба для качества спермы или показателей оплодотворяемости. Несмотря на несколько сообщений о том, что более одной пайеты можно разморозить без риска, следует соблюдать осторожность при подготовке нескольких катетеров, потому что крайне важно соблюдать надлежащие процедуры при подготовки соломинок, защищать их от перепада температур и всегда работать в рамках навыков и временных ограничений. Опытный осеменатор может размораживать несколько пайет и подготовить инструменты для осеменения до четырех коров в течение 20 минут без негативного влияния на оплодотворяемость.¹¹ В другом исследовании сделан вывод о том, что в среднем индекс зачатия различался у профессиональных техников ИО по сравнению с посредственными осеменаторами. Однако, время, прошедшее от начала разморозки до завершения четвертого ИО и последовательность осеменения (первое, второе, третье или четвертое) не оказывали воздействия на оплодотворяемость коров в группе осеменаторов.¹² Оливейра и соавт.¹³ пришли к выводу, что последовательность осеменения после одновременного оттаивания 10 соломинок может по-разному влиять на оплодотворяемость при искусственном осеменении в зависимости от используемого производителя. Независимо от количества одновременно размораживаемых соломинок, важно, чтобы соломинки перемешивались сразу после погружения, чтобы предотвратить их комкование, что приводит к снижению скорости оттаивания.

Обработка спермы после оттаивания

Смешивание воды и спермы приведет к необратимым повреждениям сперматозоидов. Следовательно, пайету после изъятия из водяной бани следует высушить (обычно бумажным полотенцем) перед тем, как разрезать. Если соломинка неисправна (например, перфорирована), ее следует выбросить.

Предотвращение температурного ( холодного) шока крайне важно в ходе обработки спермы после оттаивания. Холодный шок наносит необратимый вред сперме и вызывается быстрым снижением температуры после разморозки; это происходит, когда сперма размораживается, а затем подвергается воздействию низких температур окружающей среды перед осеменением. Холодный шок снижает подвижность и способность сперматозодов к оплодотворению из-за необратимых изменений в их плазматической мембране. Степень повреждений зависит от скорости и продолжительности падения температуры. Наиболее очевидным признаком холодного шока является потеря подвижности спермы, которая не восстанавливается при ее нагревании. Также происходит снижение скорости расщепления фруктозы сперматоцитами и уменьшение поглощения кислорода и концентрации АТФ, которые теперь не могут больше синтезироваться и использоваться в качестве источника энергии. Холодный шок вызвал приток натрия (186,2 ± 9,3 против 140,7 ± 10,2 мг/100 г сырой массы) в сперму, а также отток калия (101,6 ± 6,8 против 155,4 ± 9,6 мг/100 г сырой массы) и магния (8,1 ± 0,2 по сравнению с 11,8 ± 0,5 мг/100 г сырой массы) из сперматозоидов.¹⁴