Воспроизводство крупного рогатого скота

Глава 81

Экстракорпоральное оплодотворение

Джон Ф. Хаслер¹ и Дженнифер П. Барфилд²

1 Bioniche Animal Health, Inc., Лапорт, Колорадо, США

2 Кафедра биомедицинских наук, Лаборатория репродукции животных и биотехнологии, Университет штата Колорадо, Форт-Коллинс, Колорадо, США

Введение

На латыни in vitro означает «в стекле», а экстракорпоральное оплодотворение (IVF) часто служит общим названием процесса получения эмбрионов вне организма, который также включает экстракорпоральное созревание (IVM) и экстракорпоральное культивирование (IVC). Эти процедуры проводят последовательно — IVM–IVF–IVC — для получения эмбрионов исключительно in vitro (IVP).

В 1959 году кролик стал первым видом млекопитающих, у которого с помощью IVF удалось получить живое потомство,¹ а в 1968 году таким видом стали лабораторные мыши.² Поскольку мышь не подходила в качестве модели для крупного рогатого скота, первый успешный опыт IVF у крупного рогатого скота был проведён в 1977 году, когда сперматозоиды подвергли капацитации в яйцеводе или матке коровы либо крольчихи,³ а первый живой телёнок родился в 1981 году после переноса 4-клеточного эмбриона в яйцевод коровы-реципиента.⁴ Первые телята, полученные полностью с помощью IVM, IVF и IVC, родились в 1987 году.⁵ С тех пор исследования методов in vitro получили значительное развитие. Кроме того, методы in vitro теперь применяются в коммерческой практике совместно с переносом эмбрионов в ряде стран. В этой главе мы намерены описать наиболее современные методы получения ооцитов, получения эмбрионов in vitro и использования таких эмбрионов в скотоводстве. Некоторые области применения технологии IVF у крупного рогатого скота перечислены в таблице 81.1.

Получение ооцитов

Первоначально, in vitroПроцедуры in vitro у крупного рогатого скота первоначально проводили главным образом в исследовательских целях, используя ооциты, полученные от самок после стимуляции суперовуляции. При сборе из преовуляторных фолликулов или яйцеводов через 20–24 часов после начала течки ооциты уже прошли созревание и готовы к IVF и IVC. Ооцитам, полученным из яичников с боен, требуется IVM, поэтому исследования с их использованием отставали до усовершенствования методов IVM. Сегодня яичники крупного рогатого скота с боен широко используются как источник ооцитов.

Получение ооцитов от живого крупного рогатого скота

Основной метод получения ооцитов от живого крупного рогатого скота — аспирация из яичников, положение которых регулируют через прямую кишку, под контролем введённых во влагалище ультразвукового датчика и иглы. До разработки этого метода ооциты получали хирургическим путём через разрез в боку⁶ или при лапароскопических вмешательствах через поясничную ямку,⁷ однако такие подходы были дорогостоящими и малоэффективными, а также создавали риск образования спаек с последующей потерей плодовитости. Внедрение трансректальной ультразвуковой визуализации в реальном времени (обзор см. в источнике 8) привело к разработке методов многократного получения ооцитов от самок крупного рогатого скота. Получение ооцитов через поясничную ямку под ультразвуковым контролем было описано в 1987 году Каллесеном и соавт.⁹ а первый эффективный метод, допускающий многократное применение и предусматривающий трансвагинальную аспирацию под ультразвуковым контролем, был разработан в 1988 году.¹⁰ Этот метод получил широкую известность как извлечение яйцеклеток (OPU), или трансвагинальная аспирация. Ультразвуковой датчик с прикреплённым к нему направителем иглы, применяемый у крупного рогатого скота, показан на рисунке 81.1. Там же приведена схема введения датчика в свод влагалища, позволяющего направить иглу через стенку влагалища в яичник.

Количество ооцитов, получаемых от коровы за один сеанс OPU, зависит от множества факторов. Из механических факторов на количество полученных неповреждённых комплексов «кумулюс — ооцит» влияют разрежение, используемое для извлечения ооцита из фолликула, диаметр иглы,¹² а также длина её скоса.¹³ Ещё один фактор — частота получения ооцитов. OPU можно проводить у одной и той же коровы один или два раза в неделю без применения экзогенных гормонов. Исследования не выявили преимуществ какого-либо интервала между процедурами по числу ооцитов, полученных за один сеанс, при сравнении интервалов в 3, 4 и 7 дней.^14–16 Конечная цель — получение эмбрионов, пригодных для переноса реципиентам; с этой точки зрения имеются данные, что интервал в 3 или 4 дней (8 ооцитов за один сеанс OPU) лучше интервала в 7 дней (5.5 ооцитов за один сеанс OPU).¹⁷

Таблица 81.1 Области применения технологии IVF.

(b)

(a)

Рисунок 81.1 (а) Ультразвуковой датчик с иглой для аспирации ооцитов, выступающей из направителя иглы. (б) Схема расположения ультразвукового датчика, прижатого к своду влагалища; положение яичника регулируют рукой через прямую кишку и удерживают его у стенки влагалища. Воспроизведено с разрешения Хаслера.¹¹

Количество ооцитов, получаемых за один сеанс OPU, можно увеличить предварительным введением донору гонадотропинов.^18,19В весьма обстоятельном исследовании, в котором сравнивались различные интервалы между процедурами OPU с применением фолликулостимулирующего гормона (FSH) и без него, Chaubal и соавт.²⁰ сообщили, что наиболее продуктивный протокол по выходу ооцитов и эмбрионов включал удаление доминантного фолликула, введение FSH через 36 часов и проведение OPU через 48 часов после введения FSH. Эту схему чередовали по неделям с однократным проведением OPU без стимуляции. При еженедельном проведении OPU с применением FSH получали в среднем 10.6 ооцитов и 2.4 бластоцист, а при чередовавшемся с ним еженедельном проведении OPU без FSH — в среднем 4.6 ооцитов и 0.9 бластоцист. Взаимодействие факторов, в том числе частоты проведения OPU и применения либо отсутствия стимуляции FSH, недавно было рассмотрено в обзорной работе.²¹

Порода крупного рогатого скота также имеет большое значение. Низкое среднее количество пригодных к использованию ооцитов — от 4.1 до 5.3 — отмечали Hasler и соавт.²² и Looney и соавт.²³ в смешанных группах животных молочных и мясных пород, включавших коров старшего возраста с различными нарушениями фертильности. Применение FSH с последующим периодом без гормональной стимуляции сейчас успешно практикуется несколькими коммерческими предприятиями Северной Америки, занимающимися получением эмбрионов крупного рогатого скота in vitro; это позволяет получать в среднем около 20 ооцитов у животных Bos taurus раз в 2 недель (данные предоставлены Trans Ova Genetics). В Южной Америке (преимущественно в Бразилии) у скота породы нелоре обычно получают 17–25 ооцитов без предварительной стимуляции FSH. Нелоре — местная порода брахманского происхождения, у которой в ходе каждой фолликулярной волны, как известно, развивается больше фолликулов, чем у самок Bos indicus (данные предоставлены In Vitro Brazil).

Возраст донора также может влиять на количество ооцитов, получаемых за одну процедуру OPU. Данные по коровам голштинской породы свидетельствуют о том, что

у коров в возрасте 6–9 лет можно получать значительно больше ооцитов, чем у коров в возрасте 14–18 лет.¹⁶ Однако в основном это были животные, которым проводили OPU/IVP из-за ранее возникших нарушений фертильности. Недавно полученные неопубликованные данные крупного коммерческого in vitro в программе с участием доноров со здоровой репродуктивной системой показала, что число полученных ооцитов мало менялось до возраста 13 лет, а затем неуклонно снижалось с 14 до 18 лет (данные предоставлены Trans Ova Genetics). Примечательно, что в этой программе потенциал развития ооцитов был сходным во всех возрастных группах доноров.

Число ооцитов, получаемых от разных доноров за определённый период, значительно варьирует. Например, от 8-летней коровы голштинской породы, ранее признанной бесплодной, за 167 недель при 167 сборах ооцитов получили в общей сложности 176 эмбрионов от 23 разных быков-производителей.¹⁶ При повторных сборах методом OPU среднее число ооцитов снижалось, однако потенциал развития ооцитов, полученных методом OPU, не менялся. Это наглядно демонстрирует возможность получения большого числа эмбрионов методами OPU–IVP, а также преимущество, заключающееся в возможности использовать разных быков-производителей каждую неделю или даже раз в две недели.

Сбор ооцитов из удалённых яичников

Помимо получения ооцитов у крупного рогатого скота методом OPU, существует несколько ситуаций, в которых ооциты извлекают из удалённых яичников. При развитии у коров смертельных заболеваний или тяжёлой хромоты яичники можно удалить посредством боковой

лапаротомии или через разрез влагалища, а ооциты извлечь путём аспирации содержимого фолликулов или разрезания яичников. Stringfellow и соавт.²⁴ сообщили, что при разрезании коркового слоя яичников от 18 выбракованных молочных коров получали в среднем 46 ооцитов. В рамках весьма успешной коммерческой программы Green и McGuirk²⁵ сообщили, что в более чем 100 случаях от коров с хроническими заболеваниями, травмами и старческими изменениями получали в среднем 46 ооцитов и девять эмбрионов на одного донора.

Сбор ооцитов из яичников, полученных на бойне

Крупным источником ооцитов служат яичники коров, забитых на бойнях. Содержимое всех фолликулов диаметром от 3 до 8 mm аспирируют, а собранные ооциты используют для получения эмбрионов методом IVP. В системе массового производства с использованием яичников, полученных на бойне, Lu и Polge²⁶ сообщили о получении более 200 000 бластоцист in vitro из приблизительно 700 000 ооцитов за 2 лет. Хотя эта программа уже не действует, она продемонстрировала возможность получения эмбрионов методом IVP после убоя крупного рогатого скота. Согласно сообщениям, из одной пары яичников иногда можно извлечь 100 и даже 200 ооцитов Bos taurus яичников.²⁶В Японии яичники отдельных коров Коби получают при убое и отправляют в лабораторию для получения эмбрионов in vitro. Позднее в тот же день по стоимости туш животных с установленными индивидуальными номерами определяют, какие ооциты сохранить и провести через все этапы процедуры получения эмбрионов in vitro. Помимо коммерческого применения, эмбрионы in vitro получают в университетах и лабораториях по всему миру как ценный материал для исследований репродукции крупного рогатого скота.²⁷

Питательные среды

После сбора ооциты последовательно культивируют в нескольких средах, обеспечивающих созревание in vitro (IVM), оплодотворение in vitro (IVF) и развитие in vitro. Как правило, для получения эмбрионов in vitro используют не менее шести различных сред. Большинство этих сред не выпускается промышленно, и их необходимо готовить в лаборатории, хотя некоторые коммерческие системы сред существуют. Все эти среды содержат общие компоненты, которые кратко рассмотрены ниже; затем описаны особенности сред, используемых на отдельных стадиях развития.

Вода

Чистая вода — основной по количеству компонент всех сред, используемых при любых процедурах работы с эмбрионами. Более того, качество воды можно считать важнейшим фактором, определяющим качество сред для эмбрионов. Вопросы о том, какую воду считать чистой и как лучше всего её получать, подробно рассмотрены в литературе.²⁸

Соли

Для приготовления практически всех сред, используемых при получении эмбрионов in vitro, применяют различные соли, в том числе хлорид натрия и фосфат калия. Эти компоненты, как и все химические вещества, используемые для приготовления сред, должны быть реактивами

соответствующей степени чистоты и по возможности иметь подтверждение того, что они «прошли испытания на эмбрионах мышей».

Источники энергии

В качестве источников энергии в состав сред часто включают глюкозу, фруктозу и/или пируват. Установлено, что на ранних стадиях развития эмбрионов крупного рогатого скота оптимальная концентрация глюкозы должна быть низкой — около 0.5 mmol/L. Однако после достижения стадии поздней морулы желательна более высокая концентрация глюкозы, и большинство сред для переноса эмбрионов содержат примерно 2.0 mmol/L глюкозы.

Макромолекулы

К макромолекулам относятся сыворотка, бычий сывороточный альбумин (BSA), гиалуроновая кислота и синтетические вещества, такие как поливиниловый спирт. Важнейшая причина включения макромолекул в среды для получения эмбрионов in vitro — их поверхностно-активные свойства, благодаря которым снижается вероятность того, что эмбрионы будут всплывать или прилипать к оборудованию, наконечникам пипеток, соломинкам и чашкам Петри. В частности, сыворотка содержит широкий спектр компонентов, полезных для развития эмбрионов, включая белки, факторы роста, витамины, минеральные вещества и энергетические субстраты; установлено, что сыворотка способствует развитию бластоцист.²⁹ Сыворотка и BSA также обеспечивают ряд физико-химических свойств среды, в том числе хелатирование, регуляцию коллоидно-осмотического давления и pH. К сожалению, добавление сыворотки при культивировании in vitro (IVC) связано с высокой частотой патологий беременности и развития потомства, часто называемых синдромом крупного потомства.^30–33

Поливиниловый спирт используют главным образом как поверхностно-активное вещество в средах для вымывания и хранения эмбрионов, состав которых не включает компонентов животного происхождения. Эти среды применялись при работе с сотнями тысяч коров-доноров и дали весьма удовлетворительные результаты, о чём свидетельствуют многочисленные повторные продажи и устные отзывы большого числа специалистов по переносу эмбрионов крупного рогатого скота и лошадей (неопубликованные данные предоставлены компанией Bioniche Animal Health, Inc.).

Гиалуроновая кислота (HA) — гликозаминогликан, присутствующий в фолликулярной жидкости, а также в жидкостях яйцеводов и матки.³⁴ Показано, что на поверхности эмбрионов имеются рецепторы к HA, которая участвует в регуляции экспрессии генов, пролиферации и дифференцировки клеток. Добавление HA в системы культивирования эмбрионов крупного рогатого скота улучшает развитие до стадии бластоцисты, повышает частоту выхода из прозрачной оболочки и устойчивость к криоконсервации.^35–38 Традиционным источником HA служат петушиные гребни, однако её также можно получать биосинтетическим путём при ферментации с участием Streptococcus equi без использования каких-либо продуктов животного происхождения.

Аминокислоты

Добавление всех 20 незаменимых и заменимых аминокислот в системы культивирования эмбрионов стало практически повсеместной практикой. Роль отдельных аминокислот, а также всех 20 аминокислот в совокупности в развитии эмбрионов и повышении их жизнеспособности рассмотрел Гарднер.³⁹ При отсутствии сыворотки в средах для культивирования добавление аминокислот отчасти заменяет её полезное действие.